吲哚青绿荧光成像在早期胃癌前哨淋巴结活检中的最佳设置和准确性

概要
由于其信号稳定性，吲哚菁绿（ICG）荧光成像代表了腹腔镜胃手术中前哨淋巴结（SN）活检的有前景的方法。在本研究中，确定了ICG荧光成像在早期胃癌SN活检中的适用性和最佳设置。选择胃单发原发浅表型腺癌，病灶直径<5 cm，无明显淋巴结转移且内镜黏膜下剥离适应症的患者。在手术前一天，将ICG溶液内窥镜注射到肿瘤粘膜下层的四个象限中。 Photodynamic Eye用于检测ICG荧光。明亮的节点被定义为明显的荧光节点。共招募了72名患者; 11例转移，其中10例可通过明节活检诊断。确定ICG的适当浓度和注射体积分别为50μg/ ml（×100）和0.5ml×4点。有1例假阴性病例，这归因于冰冻切片诊断失败。这些结果表明，ICG荧光成像用于腹腔镜手术治疗早期胃癌的SN活检是可行的。然而，ICG荧光成像的弱点是亮节点评估的主观性。

关键词：胃癌，前哨淋巴结活检，吲哚青绿，荧光成像

介绍
接受淋巴结清扫的标准胃切除术的胃癌患者可能患有胃切除术后综合征（1）。由于与这些综合征相关的症状可能导致终生问题，建议采用功能保留的胃切除术和有限的淋巴结切除术来改善术后生活质量（1）。前哨淋巴结（SN）活检是迄今为止用于检测淋巴结阴性病例的最可靠方法，以及应用肿瘤学安全功能保留胃切除术。

SN被定义为直接接受原发性肿瘤淋巴引流的节点（2）。胃癌是众多研究中很好地研究SN概念的有效性的癌症之一（3-17）。最近，一项前瞻性多中心试验证明了SN活检在胃癌中的可行性（3）。然而，关于胃癌SN活检的临床应用还存在许多尚未解决的问题，包括确定腹腔镜胃切除术的适当示踪剂（3,11,12）。具有蓝色染料和放射性胶体的双示踪剂方法似乎是胃癌中的临时标准程序。然而，蓝色染料迅速劣化，并且放射性胶体在γ探针检测热节点期间表现出透光效应。这些弱点限制了它们用于腹腔镜SN活组织检查的有效性。

被评估用于腹腔镜胃切除术的一种示踪剂候选者是吲哚菁绿（ICG）。随着最近发明的有用装置如光动力眼（PDE）和超医学眼科系统，用于SN活组织检查的ICG荧光成像已广泛用于各种癌症手术中（18-27）。 ICG荧光成像具有独特的特性，包括超高灵敏度（26,28）和信号稳定性（23,26,28）。然而，尚未确定用于SN活组织检查的ICG荧光成像的最佳设置，例如ICG剂量和浓度，注射时间和活组织检查技术。此外，关于该技术的缺点知之甚少。

本研究确定ICG荧光成像是否是腹腔镜胃切除术中SN活检的合适方法。此外，还研究了该方法的最佳设置和不足。

患者和方法
患者
在2009年10月至2014年12月期间，72例组织学证实为临床0型（浅表型）胃腺癌（29），单个原发病灶直径<5 cm，既往无化疗史，无远处转移（cM0）或明显的淋巴结转移（cN0）和内镜下粘膜下剥离的适应症被纳入研究。通过术前内窥镜检查和多排检测计算机断层扫描确定临床分期。参加该研究的所有患者在金泽医科大学医院（日本石川县）的数据中心进行术前登记。

所有患者均提供书面知情同意书该研究得到了金泽医科大学伦理委员会的批准，并根据良好临床实践指南和赫尔辛基宣言进行。

SN映射程序
PDE（Hamamatsu Photonics Co.，Ltd.，Hamamatsu，Shizuoka，Japan）或PDE neo用于检测ICG荧光。 PDE neo是具有类似传感器灵敏度的PDE的较新版本。一名训练有素的外科医生进行了所有示踪剂注射，手术，映射和淋巴结采集，以避免中断学习阶段。在研究期间，腹腔镜辅助胃切除术被归类为日本胃癌协会的胃癌治疗指南中的临床研究（30）。因此，采用的手术方法（开放式或腹腔镜辅助）是基于患者在知情同意下的决定。

在手术前一天，使用内窥镜穿刺针将ICG溶液内窥镜注射到原发病灶的粘膜下层的四个象限中。将胃结肠韧带分开以显示来自胃的所有可能的淋巴流动方向。在开放手术病例中，然后使用PDE或PDE neo检测ICG荧光。对于腹腔镜辅助手术病例，将胃和胃周淋巴结拉起并从4-6cm中位上腹部切口暴露，并用PDE或PDE neo检测淋巴管和淋巴结中的ICG荧光。用于开放手术的方式。明亮的节点被定义为明显的荧光节点。据信明亮的节点包含SN。外科医生在术中观察并记录淋巴盆的数量和方向。淋巴盆被定义为由荧光淋巴管流分开的淋巴区。近端边界是附着在胃壁上的脂肪组织，远端边界是最远离胃的明亮节点的前部（4,5）。

SN活组织检查程序
根据胃癌治疗指南（30），从研究开始到2012年12月，对42名接受标准胃切除术和淋巴结切除术达D1 +或D2的顺序患者进行了SN活检的可行性。在注意到淋巴盆的状态后，进行了淋巴结清扫的标准胃切除术。在最初的16例中手术后进行明确的节点检测。手术后，收集所有解剖的节点并使用PDE分析荧光。在其他26例患者中进行术中亮节点活检。在胃移除和淋巴结清扫后，但在重建之前，在手术区域检测并采集明亮的淋巴结，并送去术中冰冻切片的病理诊断。

在该研究的可行性阶段之后，从2013年1月开始评估ICG SN作图在指导限制性手术中的临床应用。在该研究阶段，患者接受保留功能的胃切除术和淋巴盆切除术。保留功能的胃切除术包括保留幽门的胃切除术，近端胃切除术，节段性胃切除术和胃的局部切除术。淋巴盆切除术是一种选择性淋巴结切除术，用于整体切开含有淋巴结和淋巴管的淋巴盆（4,5）。切除后，在手术区域检测并收集明亮的淋巴结并送去术中冰冻切片的病理诊断。外科医生在等待病理结果的同时进行重建。对于没有转移的明亮节点，手术团队继续重建并完成手术。对于淋巴结转移的病例，将手术转为标准D2胃切除术（远端胃切除术或全胃切除术）。

手术后，使用PDE重新检查所有解剖的节点的荧光。因此，有两种类型的亮节点，术中检测到的节点和术后检测到的节点。

病理检查
根据日本胃癌分类（29），在包含淋巴结的最大尺寸的平面上进行淋巴结转移和淋巴结转移的永久性诊断。在术中冰冻切片诊断之后，在甲醛中的节点固定之后进行另外的永久性病理诊断。通过苏木精 - 伊红染色检测，淋巴结转移定义为淋巴结内肿瘤细胞，肿瘤细胞簇或肿瘤细胞巢的存在。尺寸不包括作为淋巴结转移的标准，因此，淋巴结转移包括微转移和分离的肿瘤细胞。胃的区域淋巴结被分类为根据日本胃癌分类编号的站（29）。

确定ICG的适当浓度和注射量
为了确定SN活检的足够ICG浓度，在一个或两个病例中预先检查0.5ml×4个点2.5mg / ml，125μg/ ml，50μg/ ml和5μg/ ml ICG。在确定足够的浓度后，评估了0.5ml×4点和0.2ml×4点的ICG注射体积。

结果
患者
共有72名患者参加了该研究。 这包括42名患者为可行性阶段，30名患者为临床应用阶段。 患者特征显示在表I中。在55.6％的患者中进行腹腔镜方法。 示踪剂注射后未观察到严重的过敏反应。 未观察到与SN活组织检查程序相关的术中和术后不良反应和并发症。

表I.
患者特征。

A，前壁; G，大弯; L，小弯; M，粘膜; MP，适当的肌肉; P，后壁; SM，粘膜下; SS，浆膜下。

SN活检结果
在所有病例中都检测到明亮的淋巴结和淋巴盆（图1）; 因此，ICG荧光成像的检出率为100.0％。 ICG荧光SN作图的灵敏度，特异性和准确性分别为90.1％，100.0％和98.6％（表II）。


图1。
通过吲哚青绿荧光成像与光动力学眼睛检测明亮的节点和淋巴盆。 显示远端部分胃切除术后标准淋巴结清扫至D2的术中图像。 肿瘤位于胃中三分之一的小弯处。 在淋巴管和淋巴结中检测到荧光。 在这种情况下，淋巴盆是左胃动脉区域，所有明亮的节点（*）都是no. 3。

表二。
在可行性（n = 42）和临床（n = 30）阶段的结节转移病例的明亮节点活检结果。

总共有11例转移。在可行性病例系列（n = 42）中，7例出现淋巴结转移，所有病例均可通过亮结节活检进行诊断。在这7例中，4例在术后诊断为永久性病理诊断，3例在术中诊断为冰冻切片诊断。在临床应用系列中，4例出现淋巴结转移，其中3例可通过亮节点活检进行诊断。因此，1例结节转移未能在术中诊断。

假阴性案件的细节
术中明亮节点活检导致1例假阴性病例。假阴性结果发生在一名72岁女性，患有20mm IIc型肿瘤，溃疡瘢痕位于胃中部三分之一后壁附近的较大曲率处。根据日本胃癌分类（29），最终的病理诊断是非固体型低分化腺癌，粘膜下癌，粘膜下浸润>肌层粘膜>500μm，淋巴管浸润明显，静脉侵犯最小。淋巴盆是左胃动脉和右胃网膜动脉区域，并进行腹腔镜保留幽门的胃切除术和淋巴盆切除术。解剖节点的站号是nos。在术中检测到总共8个亮节点，其中2个节点no.  3a，1个节点no.  7 和5 节点都no.  4D。手术后，在结节采集时，发现2个明亮的节点no. 3a和4d。no.  3a节点表现出弱荧光并且似乎是次级节点。no. 4d节点表现出强荧光，并且由于透光效应，似乎是术中未能检测到的节点。

共有2个淋巴结转移，并非术中检测到的明亮淋巴结。 涉及的节点都no.  4d并位于肿瘤附近。 其中一个节点是手术后检测到的明亮节点，并被归类为微转移。 另一个转移是位于明亮节点附近的非明亮节点，并被分类为分离的肿瘤细胞。 在确诊转移瘤后，进行深切割和术中检测到的明亮淋巴结的石蜡块的其他切片，并显示在其中一个中存在分离的肿瘤细胞。 4d亮节点（图2）。 进行淋巴结清扫直至D1，解剖边缘似乎无癌症。 因此，该病例被认为是一种成功的治愈性切除术。 此后，患者一直受到密切关注，迄今未发现任何复发迹象。


图2。
假阴性病例中解剖和转移淋巴结的分布模式。肿瘤位于胃中部三分之一的后壁附近的大弯（白色圆圈）。淋巴盆是左胃动脉和右胃网膜动脉区域（大箭头）。术中共检出8个明亮节点（黑色节点），节点采集时（灰色节点）术后发现2个明亮淋巴结，2个淋巴结转移，术中未发现明亮淋巴结; 1个节点是手术后检测到的明亮节点，并被分类为微转移（灰色箭头）。另一个转移被分类为分离的肿瘤细胞（白色箭头）。分类为分离的肿瘤细胞的另一个转移被诊断为术中检测到的明亮节点的深切口（黑色箭头）。胃外的小白圈代表手术期间解剖的区域淋巴结。

ICG的浓度和注射量足够
初始8例确定了足够的ICG浓度，均为淋巴结阴性。表III显示了亮节点数和ICG浓度之间的关联。案件按发生顺序排列，以显示决策过程。在ICG浓度为5μg/ ml（×1,000）时，尽管荧光弱，但仍检测到明亮的淋巴管和明亮的淋巴结。因此，确定足够的ICG浓度为50μg/ ml（×100）。

表III。
亮节点数与吲哚青绿浓度之间的关联。

接下来，确定足够的注射体积50μg/ ml ICG。总共15和19位连续患者分别注射0.5ml×4点和0.2ml×4点50μg/ ml ICG。明亮节点和明亮淋巴管的可视化在两组之间非常相似。两组之间亮节点的中位数没有显著差异，0.5ml组中6个（范围3-11），0.2ml组中6个（范围2-7）。因此，由于其技术可靠性，确定ICG溶液的足够注射体积为0.5ml×4个点。

明亮节点数
在本研究中，68名患者注射了50μg/ ml ICG溶液。在这些患者中，仅在14名患者中检测到明亮的淋巴结，但在54名患者的术中和术后均检测到。在术后仅手术和术中病例中，亮节点的中位数分别为5（范围，4-11）和6（范围，2-9）。在54例术中病例中的27例（50.0％）中，术后也检测到留下的明亮节点。这些情况下的节点总数为49，每种情况的中间节点数为1（范围，0-4）（表IV）。在这49个节点中，31个（63％）表现出弱荧光，18个（37％）表现出强荧光。几乎所有强荧光节点都是直径<5 mm的小节点，位于胃的浆膜附近，被脂肪覆盖，并且由于浆膜亮点的透光效应而难以在术中检测到。相比之下，具有弱荧光的31个节点远离肿瘤并且看起来是次级节点。

表四。
亮节点数与节点检测时间之间的关联。

转移淋巴结的分布
本研究中的所有解剖节点分为以下三组：明亮淋巴结，淋巴盆内非明亮淋巴结和淋巴盆外非明亮淋巴结。共有11例（15.3％）出现淋巴结转移。在其中10例中进行了淋巴结清扫至D2，而另一例则是假阴性术中病例。因此，在这些病例中，很好地检查了淋巴盆内外（直至D2）的转移淋巴结的分布。转移淋巴结总数为35个，其中22个（62.9％）为明亮淋巴结，12个（34.3％）为盆地内非明亮淋巴结，1个（2.9％）为盆地外非明亮淋巴结。

11例淋巴结转移病例中，5例均为明亮淋巴结转移淋巴结，5例淋巴结转移淋巴结明亮，非明亮淋巴结。在其余情况下，转移节点不仅位于盆内，还位于盆外。该病例涉及一名62岁的男性，其肿瘤位于胃下三分之一的大弯处。宏观结果显示，IIc肿瘤大小为40×30 mm，病理结果为中度分化的管状腺癌，固有肌层的肿瘤侵袭，肿瘤轻度浸润性生长，与周围组织轻度模糊不清，中度淋巴和静脉侵犯，基于日本胃癌分类（29）。淋巴盆是右侧胃网膜动脉区，5个明亮的淋巴结no. 4D。基于螺旋计算机断层扫描的术前诊断为cN0，即使患者在第4号台站有明显的宏观转移淋巴结。 no. 6 患者出现7个转移节点，包括2个明亮节点，盆内有4个非明亮节点，盆外有1个非明亮节点（第7号）。由于存在巨噬细胞酶和易于转移诊断，因此认为该病例不适用于SN活组织检查。

ICG SN活检的临床应用
总共有30例用于评估ICG荧光SN导航用于指导有限手术的有效性。手术的具体情况见表V.在30例（66.7％）中，20例进行了功能保留的治疗性胃切除术和淋巴盆切除术（超出指南程序的有限手术）。迄今为止，在这些病例中均未发现任何复发迹象。

表五
手术在可行性和临床阶段进行。

在临床阶段进行的功能保留治疗手术的类型和数量以粗体显示。 DG，远端胃切除术; LA，腹腔镜辅助; meta（+），淋巴结转移阳性; meta（ - ），淋巴结转移阴性; PG，近端胃切除术; PPG，幽门保留胃切除术; SG，节段性胃切除术; TG，全胃切除术。

讨论
即使在胃癌中，SN概念的有效性仍然存在争议。在过去的几十年中，SN映射在具有相对复杂的淋巴流动的胃癌中的应用一直是一个有争议的问题（31）。然而，最近的前瞻性研究已经成功证明了SN活检在胃癌中的应用（6-10）。最近，进行了两项大规模的全国性多中心前瞻性研究，JCOG0302研究（11）和Kitagawa等人的SN导航手术（SNNS）研究（3），以评估胃癌中的SN图谱。 JCOG0302研究提供了支持在胃癌中使用该技术的证据。然而，由于在术中组织学检查中获得的假阴性结果比例很高，JCOG0302试验终止（11）。 JCOG0302研究结果受术中SN检测技术和术中淋巴结转移诊断的影响。相比之下，SNNS研究专门用于验证胃癌中的SN概念（3）。

SN活检被认为在各种癌症中表现出两个主要作用，即超分期和淋巴结清除遗漏的指导。在恶性黑素瘤和结肠直肠癌管理中，SN活检主要用于超级分期（2,32）。相比之下，SN活检主要用于指导乳腺癌手术中淋巴结清扫术的遗漏（33）。对于胃癌，临床研究主要集中在SN活检在指导淋巴结清扫遗漏方面的应用。然而，淋巴结清扫遗漏值得谨慎，因为标准淋巴结清扫与胃癌患者的预后改善相关（34）。此外，与乳腺癌相比，在胃癌中很少进行额外淋巴结清扫的再次手术（5）。

SN活检是一种复杂的多步骤手术技术。该技术需要适当限制适应症，选择适当的示踪剂，适当的示踪剂注射方法，客观检测节点的示踪剂摄取，可靠的活检技术，用于显示示踪剂摄取的节点和精确的术中检测（微转移水平的淋巴结转移。许多研究提供了关于胃癌SN活检的合适适应症和示踪剂注射方法的建议。在Wang等人的胃癌SN活检的荟萃分析中，早期T期，粘膜下注射方法，联合示踪剂，常规开放手术和免疫组织化学应用被证明与更高的SN鉴定率和更高的相关性灵敏度。

选择适当的胃癌SN图谱示踪剂一直是一个重要问题（3,11,12）。临时标准是与锝-99m锡胶体和异硫氰蓝的组合映射。然而，蓝色染料迅速恶化，并且放射性胶体在γ探针检测手术区域中的热节点期间表现出透光效应。作者认为组合标测不适用于腹腔镜胃切除术。

ICG是腹腔镜胃切除术的有希望的示踪剂候选者（14,15）。 ICG吸收近红外范围内的光，在800nm波长下具有最大吸收。 ICG在与血浆蛋白结合后也发出840nm波长的最大荧光。 Nimura等（13）开发了一种用于ICG检测的红外线电子内窥镜系统。 Kusano等（14）证明了这种ICG荧光成像系统对胃癌SN图谱的高灵敏度。 ICG荧光成像的优势在于ICG成本低，与放射性示踪剂相比设备成本更低，无需放射性，与蓝色染料相比，过敏反应频率更低，能够检测厚脂肪组织下的明亮节点（14） ，与肉眼或红外线成像相比，清晰可视，易于检测明亮节点和淋巴管（23），能够检测微小ICG浓度（26,28）和信号稳定性的超高灵敏度（23,26,28） ）。信号稳定性是ICG荧光成像的独特特征（15）。 ICG荧光成像的稳定性使作者能够成功地使用术前注射进行SN检测。然而，ICG荧光成像也具有某些明显的缺点，例如对荧光检测设备的需求和潜在的透光效应。该技术的高灵敏度也是一个缺点，因为它可能导致亮节点的二次节点污染。

根据作者的经验，50μg/ ml ICG足以通过PDE进行检测。在该浓度下，本研究中亮节点的中位数为6，这与作者之前的染料方法研究中获得的数量相似（4）。此外，无论手术方法，即腹腔镜手术还是开放手术，都获得了灵敏度和准确度的良好结果。在Yoshida等人的研究中，HyperEye Medical System也使用50μg/ ml ICG浓度（26）。然而，如果使用其他检测装置，则应重新检查ICG的适当浓度。

胃癌的SN活检还需要可靠的亮节点活检技术和客观的明亮节点检测。关于活组织检查技术，即使对于ICG荧光成像也必须使用淋巴盆切除方法。与其他癌症不同，淋巴盆切除术是胃癌的标准技术（4,5）。淋巴盆被认为是每个患者的主要淋巴引流区域，那些患有胃癌的个体通常表现出两个或三个（3,4,5,16,17）。淋巴盆解剖优于普通的拾取方法，不仅在防止错过亮节点方面，而且在肿瘤学安全性方面，因为它通过作为后备夹层来补充术中病理诊断（5,16,17） 。与活组织检查技术相反，客观明亮节点检测仍然是SN活组织检查的未解决问题。在本研究中，在术中病例中术后检测到一些明亮的节点。这些节点在明亮节点的术中活检后留在淋巴盆中，并且有两种类型：由于原发病灶的透光效应而在术中活组织检查中遗漏的强明亮节点，以及弱亮节点被认为是次要节点。通过使用淋巴盆解剖方法并在从胃壁解剖盆后进行亮节点检测，可以消除透光效应。然而，次级节点污染是有问题的，因为真正的SN难以与次级节点区分。已经开发出具有荧光和胶体颗粒特征的新型荧光剂（35-39）。这些新型试剂仅检测荧光SN而不是次级节点，因此，对于在胃癌中进行腹腔镜SN活检是最有潜在用途的。此外，它们可能单独用作标准示踪剂，而不是与其他SN映射示踪剂组合使用。

进行SN活检的最重要问题是术中诊断淋巴结转移。用快速苏木精 - 伊红染色进行冷冻切片诊断可能导致误诊。在本系列中，由于冰冻切片诊断失败，仅发生一例假阴性病例。为了解决这个问题并建立肿瘤学安全性，应开发用于诊断淋巴结转移的分子方法，例如逆转录酶 - 聚合酶链反应和一步核酸扩增试验，以供临床使用（40,41）。

总之，用于SN活检的ICG荧光成像在早期胃癌的开腹和腹腔镜手术中是可行的。 与PDE一起使用的最佳示踪剂设置是在手术前一天在肿瘤周围的四个点处内窥镜粘膜下注射0.5ml的50μg/ ml ICG。 ICG荧光标测中转移淋巴结的分布与盆理论一致（3,4,5）。 因此，ICG荧光SN活检可用于指导淋巴结清除遗漏，从而允许功能保留胃切除术和淋巴盆切除术。 ICG荧光成像的弱点是SN评估的主观性和潜在的二次节点污染。 目前的研究结果也提出了淋巴结转移的分子诊断的要求。

参考：
Optimal settings and accuracy of indocyanine green fluorescence imaging for sentinel node biopsy in early gastric cancer
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