基于肿瘤相关自身抗体策略的抗原芯片与肿瘤标志物识别

以目前对肿瘤的病因病机的基础研究现状，尚不能对绝大多数肿瘤进行病因预防；同时，恶性肿瘤发现在早期阶段和中晚期阶段，直接关系着患者的5年生存率。所以，在现今全球肿瘤发病率呈上升趋势的状态下，作为肿瘤二级预防范畴的早诊早治显得尤为重要。理想的肿瘤标志物的敏感性和特异性都接近100%，然而现在用于临床诊断的绝大多数标志物如PSA和CA125都不能达到这种水平。基于蛋白质组学技术发展的抗原芯片技术，为寻找肿瘤标志物的研究提供了重要手段，本文就此综述如下。

1 基于肿瘤相关自身抗体策略的抗原芯片概述

通过对血清进行比较蛋白质组学的研究，可发现蛋白质种类和丰度的变化，识别异常表达的蛋白。然而血清样品中蛋白质种类多，动力学范围较大，能成为肿瘤标志物的蛋白往往是低丰度蛋白，且往往处于动态变化过程，尽管血清中的抗原是低丰度或瞬间表达，但抗体存在相对稳定，尤其是在局部产生免疫反应的抗原释放入血就更少，甚至完全不可能通过任何技术检测出来，但通过机体的免疫反应的级联放大效应仍然能识别他们。已发现人类许多肿瘤的发生发展都伴随着肿瘤免疫的过程，在细胞恶变过程中产生出具有免疫原性的新的大分子物质，即为肿瘤抗原。人或动物有识别“异己”的能力，可在体内产生相应的抗体或引起特异的细胞免疫反应。虽然肿瘤患者体内产生肿瘤自身抗体的机制目前仍未完全阐明，但一般认为是由于癌变过程中基因突变、蛋白异常和异位表达、蛋白异常修饰等原因产生的一些特异的蛋白和多肽导致机体免疫系统被激活而产生出靶向这些肿瘤抗原的自身抗体，而这些异常存在的抗体有可能成为肿瘤的诊断标志物。

自1982年在乳腺癌患者血清中首次检测到p53抗体，迄今已鉴定了2000多个可诱导机体产生自身抗体的肿瘤抗原，肿瘤患者和正常人的血清中肿瘤自身抗体存在显著差异，能作为肿瘤诊断的血清标志物。如最近Farlow等鉴定了16种肿瘤相关自身抗体在非小细胞肺癌中异常表达，其中6种抗体可识别出高风险人群。识别血清差异抗体可对肿瘤进行诊断，目前用于检测免疫反应中抗体活性的常用方法是酶联免疫吸附试验，但其主要的不足在于只能检测单个或有限的抗体，而多个标志物的联合检测，是提高敏感性和特异性的重要方法，高通量芯片技术的发展，为这方面的研究提供了重要工具。

2 基于肿瘤相关自身抗体策略的抗原芯片的类型及应用

目前检测肿瘤相关自身抗体的抗原芯片技术平台主要为重组抗原芯片和天然抗原芯片。前者是将一些特定的重组蛋白固定在芯片表面（这些特定蛋白也可通过噬菌体展示技术来完成），与待检血清孵育，捕获自身抗体进行分析。后者是指通过固定在芯片上的蛋白为天然抗原，即将细胞裂解后的蛋白分离后作为芯片；或通过预先固定特定抗体以捕获细胞裂解液中的蛋白，这些被捕获的蛋白作为诱饵再与抗体进行结合。

2.1 重组抗原芯片

2.1.1 联合噬菌体展示技术的抗原芯片识别肿瘤相关自身抗体 表达在噬菌体衣壳蛋白上的目标cDNA可成为生物筛选工具，高亲和力的靶分子（如自身抗体）与固相上噬菌体衣壳蛋白结合，可完成对患者和对照血清的筛选。Wang等应用此方法对前列腺癌患者血清与对照血清进行检测。他们固定了表达在噬菌体衣壳上源于前列腺癌细胞的2304种蛋白，对20例前列腺癌和11例对照血清进行分析，初步筛选出能与血清抗体产生阳性反应的186种蛋白，再将它们对119例前列腺癌和138例对照血清进行分析，发现联合其中22种蛋白对前列腺癌诊断的敏感性和特异性可达81.6%和88.2%，此结果明显优于单用PSA进行诊断。Zhong等采用该策略对非小细胞肺癌的血清差异抗体进行检测，初步筛选出能与血清抗体发生反应的212种蛋白质，将其对23例1期非小细胞肺癌和23例对照进行分析，获得5种差异明显的自身抗体，再对46例非小细胞肺癌确诊之前0～5年的患者和56例暴露因素匹配的对照血清样本检测这5种自身抗体；其敏感性和特异性分别为82.6%和87.5%，以此作为生物标志物可较准确的预测非小细胞肺癌的发生，甚至可在CT诊断之前5年作出预测。

有学者也采用了联合噬菌体展示技术的抗原芯片识别来自卵巢癌患者血清中的抗体，发现其中有65种蛋白可识别血清自身抗体，这些蛋白一些是已知的，如RCAS1等，还有一些是过去未发现的新蛋白质，将这65种蛋白对癌血清进行联合诊断，敏感性和特异性分别为55%和98%。Lin等应用该技术筛选出130种与头颈部鳞癌相关的自身抗体，进行联合诊断的敏感性和特异性分别为79.8%和90.1%。Babel等将1536种大肠癌抗原基因的cDNA噬菌体表达文库对大肠癌患者的血清与对照血清进行筛选，发现128种能识别肿瘤血清，通过测序确定了43种肽段，进一步选择其中6种（STK4/MST1、SULF1、NHSL1、SREBF2、GRN和GTF21）进行联合诊断，其ROC曲线下面积为0.86，它们对早期（A期和B期）大肠癌血清辨别能力的曲线下面积为0.786。

2.1.2商品化蛋白芯片识别肿瘤相关自身抗体 采用商品化蛋白芯片识别自身抗体常用于对自身免疫疾病生物标志物的研究，现也应用于肿瘤标志物的研究。Gnjatic等采用包被8000余种蛋白的芯片对卵巢癌和胰腺癌患者的血清检测，发现分别有202种蛋白和29种蛋白能特异识别卵巢癌和胰腺癌血清。Babel等也用此技术对20份结肠癌患者血清抗体进行检测，发现43种蛋白能识别肿瘤血清，其中5种蛋白（PIM1、MAPKAPK3、STK4、SRC和FGFR4）对应的抗体在血清的表达有很高的一致性。

2.2 天然抗原芯片

重组抗原芯片识别肿瘤相关自身抗体可作为研究肿瘤标志物的一个较好的策略，但重组蛋白很有可能丢失掉一些翻译后修饰的重要结构，使不能与自身抗体进行反应，而天然抗原芯片在保留与疾病相关翻译后修饰的重要结构方面显示出了优势。

2.2.1 联合细胞裂解、蛋白分离的天然抗原芯片识别肿瘤相关自身抗体 Bouwman等首次报道了应用天然抗原芯片对前列腺癌患者血清自身抗体进行筛选。他们将前列腺癌LNCaP细胞裂解液二维分离出的1760种蛋白包被在玻片上，检测25例前列腺癌及对照血清，发现40种蛋白能分辨出80%以上的癌血清。通过联合细胞裂解、蛋白分离的天然抗原芯片识别血清差异抗体后，若要对靶抗原鉴定，还得进一步采取其他的技术进行分析。Patwa等应用天然抗原芯片对前列腺癌进行研究，对差异表达的蛋白进行质谱分析，获得了磷酸酶-1和抗组蛋白H4。Kim等应用该技术分析卵巢癌患者治疗前后的血清样本，质谱分析获得磷酸化应激诱导蛋白-1（STIP1），进一步研究发现，卵巢癌组织中STIPlmRNA和蛋白过度表达，且癌血清中抗STIP1自身抗体滴度升高。

2.2.2 反向捕获抗体芯片识别肿瘤相关自身抗体 反向捕获抗体芯片技术由Qin等最初报道，该技术以双抗体“三明治”技术为基础，基本平台是排列在玻片上500种特异性单抗，能与来自组织或细胞的裂解蛋白即天然抗原结合，抗原以其天然构象被捕获在抗体芯片上，再与待检血清中的抗体反应。待检样品和对照分别以不同的荧光标记物交叉标记，并采取反标后的双芯片检测，以控制不同染料在标记时效率不同和抗体结合效率不同所导致的差异，芯片扫描后软件分析荧光强度即抗体反应活性。并报道了应用该方法分析前列腺癌及卵巢癌患者血清差异自身抗体的技术流程。Tang等应用该技术研究吸烟与黏液性卵巢癌的关系，发现，35种自身抗体在黏液性卵巢癌患者血清中明显升高，其中6种抗体在吸烟暴露的患者血清中差异表达。Ehrlich等应用该技术对10例前列腺癌和5例良性前列腺增生进行研究，发现了28种差异表达的血清自身抗体，其靶蛋白中有一种是目前研究已证实的与前列腺癌有关的的蛋白，有几种是已证实与许多恶性肿瘤相关的蛋白，余下的蛋白质与前列腺癌的关系未知，尚需进一步研究。

3 问题与展望

天然抗原芯片与重组抗原芯片相比，其优势在于它能更多保留蛋白质天然构象，保留抗体能识别的翻译后修饰的位点。反向捕获抗体芯片作为天然抗原芯片的发展，除具有这方面的优势之外，还因所捕获的天然抗原都为已知，故不需再行额外实验对蛋白质鉴定。但反向捕获抗体芯片技术仍存在以下不足。由于商品化抗体芯片抗体数量有限，若待检的自身抗体在这之外，就不能被识别出来；其次，固定在芯片上的抗体为人工合成，可能会无法识别抗原上的一些靶位点，但随着高质量和高特异性抗体的生产工艺的改进，将能弥补这些不足。

总之，肿瘤标志物的识别所面临的主要挑战是在众多的蛋白质成分中识别有意义的低丰度蛋白，基于免疫蛋白质组学的芯片技术的发展和对肿瘤标志物识别的应用，还有赖于各种基础研究技术和生物信息学的发展，相信在不久的将来能发展成为肿瘤诊断的有效手段。