乙型肝炎病毒前S区缺失突变与乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的关系

流行病学调查显示，慢性HBV感染是肝细胞癌（肝癌）发生的重要危险因子，但HBV的致癌机制至今不甚清楚。近年研究显示，HBV前S区缺失突变与肝病进展相关。本研究采用PCR测序法调查HBV相关肝癌患者和慢性乙型肝炎患者HBV前S区缺失突变频率，探讨前S区缺失突变与HBV相关肝癌的关系。

资料与方法

一、研究对象

30份HBV相关肝癌患者血清（HBV相关肝癌组）和40份慢性乙型肝炎患者血清（慢性乙型肝炎组）均来自福建医科大学附属传染病医院2009年4月至2012年5月住院患者，所有血清标本-40℃保存。本研究HBV相关肝癌的定义：①符合2001年9月中国抗癌协会肝癌专业委员会制订的原发性肝癌的临床诊断与分期标准；②血清HBV DNA≥420拷贝/ml；③排除其他原因引起的肝炎、肝硬化等肝脏疾病。慢性乙型肝炎诊断标准参照2005年中华医学会肝病学分会和中华医学会感染病学分会联合制订的慢性乙型肝炎防治指南。

二、HBV DNA提取

采用上海复兴公司生产的核酸提取试剂提取血清HBV DNA，严格按说明书操作，HBV DNA标本40℃保存。

三、前S区基因扩增和序列测定

采用丁静娟等的方法扩增HBV前S区基因，PCR产物由上海博尚生物技术有限公司测序。

四、生物信息学分析和统计学处理

测序序列应用MEGA 5.0处理并与GenBank中HBV标准型序列（http：//http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/view.cgi?db=2）比对。采用SPSS 15.0软件进行统计学处理，组间前S区缺失突变率比较采用卡方检验，多因素分析采用成组Logistic分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、两组患者一般情况比较

HBV相关肝癌组患者的年龄、性别、HBV基因型、血清HBV DNA水平和HBeAg阳性率等与慢性乙型肝炎组的差异均无统计学意义（均P＜0.05），见表1。

表1 HBV相关肝细胞癌组和慢性乙型肝炎组患者的一般资料比较

注：HBV为乙型肝炎病毒

二、前S区缺失突变与HBV相关肝癌的相关性

50.0%（15/30）HBV相关肝癌患者检测到前S区缺失突变，而慢性乙型肝炎组前S区缺失突变检出率仅22.5%（9/40），两组比较差异有统计学意义（X2=4.667，P=0.031）。将慢性乙型肝炎组和HBV相关肝癌组组间HBV基因型和HBV DNA纳入多因素Logistic分析，结果提示前S区缺失突变与HBV相关肝癌的发生有关。见表2。

表2 HBV相关肝细胞癌危险因素多因素分析结果

注：HBV为乙型肝炎病毒

三、前S区缺失突变特点

前S区缺失突变集中发生在前Sl的3'端部分至前S2区5'端部分，总共24例前S区缺失突变可大致分为4类：前S1缺失突变、前S2缺失突变、前Sl区3'端至前S2区5'端缺失突变和前S1缺失突变联合前S2缺失突变，以前S2缺失突变为主，占所有缺失突变的91.7%（22/24）。

缺失片段长9～183 bp不等，除1例前Sl缺失突变联合前S2缺失突变外均为3的倍数，不引起后续序列框移突变，其中以第45～53位缺失9 bp最多见，共7例（21.2%），其次是第27～56位缺失30 bp 4例（16.7%），第24～56位缺失33 bp3例（12.5%），其余各1例，见图1。

注：深色方框示前S1区，浅色方框示前S2区，虚线示缺失的核苷酸，虚线两端的数字示缺失起始和终止核苷酸的位置。0为前S区基因示意图，1～12为本研究检测到的12种前S区缺失突变类型

图1 乙型肝炎病毒前S区缺失突变示意图

除2例前Sl区3'端至前S2区5'端缺失突变导致前S2起始密码子缺失外，其余缺失突变均未伴随前S2起始密码子和HBsAg起始密码子突变，可编码截短的外膜大蛋白和中蛋白。

讨 论

慢性HBV感染者体内的HBV基因组常发生突变，HBV基因突变与病毒持续感染和疾病进展有关。本研究中HBV相关肝癌患者前S区缺失突变检出率高达50.0%，显著高于慢性乙型肝炎患者，与以往文献报道相近，提示前S区缺失突变与HBV相关肝癌的发生有关。

本研究显示，前S区缺失突变多发生于前S2的5'端部分。由于前S2区N端含有B细胞表位，因此，前S2的5'端缺失可能导致这些缺失突变株部分或完全缺失B细胞表位，从而逃避宿主免疫监视并被选择出来，最终成为体内优势株，持续感染肝细胞。此外，前S区缺失突变还可影响热休克蛋白70结合位点、核衣壳结合位点和细胞溶质锚定因子（cytosolic anchorage determinant，CAD）等，从而影响病毒分泌，或者前S区缺失的外膜大蛋白和（或）中蛋白可能由于构象改变，聚积在内质网内诱导内质网应激，从而参与肝癌发生。

综上所述，HBV前S区缺失突变与HBV相关肝癌的发生有关。前S区缺失突变株可能是一种免疫逃逸株，通过持续表达前S区缺失突变的外膜大蛋白和中蛋白诱导内质网应激，参与肝癌发生，但有待进一步的研究证实。