长链非编码RNA在肝癌中的表达及其功能

人类基因组中，参与编码蛋白的RNA仅占1/5，而4/5的转录子是非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）。长链非编码RNA（long non coding RNA，LncRNA）是一类在基因组转录中不参与编码蛋白、长度超过200个核苷酸的转录产物，具备多种生物学功能并在各种生物进程中发挥重要作用：如染色质修饰、转录、翻译、剪接、表观遗传学调控等。随着研究的深入，证实lncRNA的变异和调节异常能够导致包括肿瘤在内的多种疾病。本文综述了lncRNA在肝癌中存在特异性表达和调节异常的研究，并探讨lncRNA影响肝癌发生、发展的可能机制。

1 LncRNA的生物学功能

LncRNA的染色质修饰功能可通过2条途径实现：一是介导染色质重构复合物到特定的基因位点引起表观遗传学改变；其二是通过基因沉默或染色体失活。如HOTAIR是源于基因位点HOXC的lncRNA，通过结合染色质重构抑制性复合体2（poly-comb repressive complex2，PRC2）形成一个染色质抑制区并沉默HOXD位点的转录。X染色体失活则是由内源性RepA位点非编码转录产物X染色体失活特异转录本Xist，通过介导PRC2结合于染色质来调控的。

LncRNA能介导RNA结合蛋白与蛋白编码基因启动子整合以增强其对转录的调节作用；或者作为协同因子调节转录因子的活性。在人类蛋白编码基因上游区域二氢叶酸还原酶基因DHFR位点转录的lncRNA，与启动子形成三聚体，阻止转录协同因子TFIID与之结合，这种与转录起始复合物相互作用的方式，是真核生物染色体中普遍存在的RNA聚合酶Ⅱ活性调控机制。此外，lncRNA还可以与RNA聚合酶Ⅱ依赖的转录复合体基本功能因子相互影响，从而实现转录的全面调控。由于lncRNA能够识别互补序列，因此对转录后mRNA的剪接、编辑、翻译和降解等不同阶段均具有调节能力：反义非编码RNA能与mRNA的关键顺式序列形成互补双链，干预此段序列的剪接，并进一步影响其有效翻译和蛋白表达；而互补双链或lncRNA扩展的发夹结构退火后形成的RNA复合物在Dicer酶作用下产生内源性的siRNA，以调控基因表达。

2 LncRNA在肝癌中的异常表达

自从lncRNA的生物学功能被关注以来，其在各种疾病中的差异表达与疾病发生机制的关联性研究也逐渐开展和深入。LncRNA是否在恶性肿瘤中存在特异性表达在早期研究中已经被提出，但是缺乏足够的证据支持。随着肿瘤基因组学和转录组学研究的发展，越来越多的证据显示：不仅在同型肿瘤中可存在不同的lncRNA，而且同一种lncRNA也可在不同肿瘤中表达。

目前研究发现与肝癌相关的lncRNA有7个：H19、MALAT1、UCA1、uc.338、MEG3、HULC和HEIH。H19基因编码的lncRNA高表达于人胚胎阶段，而在出生后的大多数器官组织中lncRNA表达迅速下调，在肝癌组织中H19的转录再次被重新激活。MALAT1是一种在正常人组织中广泛存在的lncRNA，而在肝癌组织中表达异常增高。UCA1是通过cDNA末端陕速扩增技术克隆而成的基因，其转录的lncRNA与胚胎发育和膀胱癌密切相关，而在肝癌组织中也发现其不同程度的表达。TUC338是根据多聚胞嘧啶结合蛋白2基因的转录片段uc.338克隆形成的转录产物，uc.338在人肝癌组织和细胞株中显著上调。MEG3并不在肝癌组织中表达，但是研究发现将其转染至肝癌细胞株能抑制肝癌的生长。虽然大量已知lncRNA在各型肿瘤中表达，但仅在一种肿瘤组织中呈特异性表达的lncRNA并不多：HULC在原发性肝癌和结肠癌的肝转移癌组织中高表达，但在原发性结肠癌中和其他非肝转移的转移癌组织中未见明显表达；而另一种在肝癌中特异性表达的HEIH，与肝癌发生、转移以及患者预后相关。

3 LncRNA与肝癌的发生

由于lncRNA几乎参与基因调控的每一个环节，从转录到mRNA剪切再到RNA衰减和翻译，因此，任一环节的功能异常都有可能影响肿瘤（包括肝癌）的发生。

3.1 基因印记缺失

基因印记缺失是指正常不表达的等位基因的异常激活或正常表达基因的异常沉默，是导致基因表达异常并引发肿瘤的重要因素。H19位点编码的lncRNA的表达来自母体等位基因，H19在胚胎发育期呈高表达，但在出生后短期内迅速下调，该位点印记性表达缺失导致H19在原发性肝癌和转移性肝癌的过度表达。引起H19印记性表达缺失的机制目前尚有争论，H19能够直接被致癌转录因子激活、、并共同影响下游基因表达；或者通过抑制转录激活因子和抑癌基因从而引起肿瘤的发生；H19也是微小RNA（microRNA）675的前体，microRNA675能通过下调抑癌基因RB1使其成为肿瘤的诱发因素。

HOTAIR是转录于HOXC位点的lncRNA，通过介导组蛋白去甲基酶LSD1与PRC2的相互作用，并作为转录沉默因子的辅抑制物，沉默HOXD位点的转录。通过与PRC2关联的基因沉默是LncRNA致癌的重要机制。Yang等通过假设在肝癌高表达lncRNA-HEIH与PRC2的潜在关联性，从肝癌细胞株Huh7和HCCLM3中提取PRC2的重要亚组EZH2，应用EZH2的抗体拮抗，发现原本被沉默的PRC2的目标基因p15、p16、p21、p57均被逆转而表达上调；同时研究结果证实，HEIH在肝癌组织中的高表达促进肝癌的生长机制与介导染色质修饰的复合体（如PRC2、EZH2）以及对应的目的基因沉默密切相关。除此之外，在INK4位点转录lncRNA的ANRIL同样通过结合PRC1和PRC2引起INK4b-ARF-INK4a位点的基因沉默，而该位点参与多种抑癌基因编码，在细胞周期调控、干细胞更新凋亡、细胞老化调节等方面发挥重要作用。

3.2 启动子区域甲基化异常

表观遗传学改变能直接影响lncRNA的正常功能，除了基因印记表达缺失和基因沉默外，编码lncRNA区域的甲基化异常也是肿瘤发生的重要原因，同时可能导致肿瘤的转移。国内学者比较肝癌组织与正常肝组织H19基因差异甲基化区的甲基化程度，证实过高或过低的甲基化都能引起H19印记表达异常。与肿瘤抑制相关的MEG3在肿瘤中表达缺失，而研究结果显示其启动子的过度甲基化是抑制MEG3表达的重要原因；T-UCR启动子区域的CpG岛的过度甲基化同样能抑制MEG3正常表达。

3.3 LncRNA与microRNA的耗竭

HULC是原发性肝癌中表达显著的lncRNA，具有mRNA结构特征但不具备蛋白编码功能，除了在原发性肝癌组织高表达，在结肠癌的肝转移组织中同样表达上调。HULC在肝癌细胞中表达上调及功能的机制在最近的研究结果中被逐步揭示：在肝癌细胞特殊的内环境中cAMP反应元件结合蛋白CREB活化使HULC的表达上调，并激活HULC上microRNA372的结合位点吸附能力；HULC的高表达促使microRNA372的耗竭，而microRNA372能抑制以CREB为靶点的环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶PRKACB的翻译，其耗竭让CREB得到进一步活化，因此在肝癌中HULC表达显著增高。Wang等的研究结果表明：microRNA372的减少是HULC抑制其他相关microRNA的诱因，“microRNA海绵”的吸附作用并不是HULC减低microRNA水平的独有特性，与抑癌基因PTEN相对应的转录产物PTENP1同样具有与microRNA结合的3'UTR区域，通过与降解抑癌基因的microRNA的结合，PTEN得以正常表达。而PTENP1的表达缺失以及microRNA结合位点的变异是多种肿瘤发生的重要原因。

3.4 T-UCR的异常表达

T-UCR是在人类基因组编码和非编码区域均存在的绝对保守序列，其高度保守特性决定了它们在各组织的特异性表达，而在多种肿瘤中T-UCR的表达明显改变。uc.338是由PCBP2基因独立转录形成的转录片段，在人原发性肝癌及细胞株内明显上调，将克隆这段转录片段而成的TUC338转染至肝癌细胞株中发现，抑制TUC338的表达能明显抑制肝癌细胞的增殖，同时上调抑癌基因p16的表达。虽然T-UCR在肿瘤中的表达机制尚不明确，但过度甲基化能抑制T-UCR的表达，说明其在肿瘤中的调控机制与表观遗传学改变有关。此外，microRNA能结合并下调T-UCR，说明非编码RNA之间在肿瘤发生中存在复杂的相互调节机制。

4 LncRNA与肝癌的转移

MALAT1是最早发现于肺癌组织的lncRNA。MALAT1转录位点包括染色体易位的断点，其高表达与肝癌的高度转移风险以及不良预后同样密切相关：MALAT1能在正常组织中表达，在包括肝癌在内的多种肿瘤中呈高表达。Tripathi等的研究结果发现：通过RNA干扰技术和RNA短发夹结构干预MALAT1的高表达能够在转录、转录后水平抑制肿瘤细胞的体外增殖和侵袭力，而MALAT1通过调节参与RNA剪接的SR蛋白活性调控转录后的选择性剪接。之前提到的HOTAIR不仅能影响肿瘤发生，还与肿瘤转移的关系密切。这种lncRNA最早发现在原发性和转移性乳腺癌组织中表达上调，高水平的HOTAIR表达意味着肿瘤的高转移率和患者的低生存率。HOTAIR的表达上调介导PRC2与靶点的结合，并作为转录沉默因子的辅抑制物，阻止肿瘤转移抑制基因的转录，提高肿瘤转移的风险。

5 LncRNA与肝癌生长的抑制

MEG3是少数与肿瘤抑制相关的lncRNA之一。在人类多数正常组织中均有不同程度的表达，在大脑组织和垂体中表达最高，而在人类肿瘤组织及细胞株中表达缺失，说明MEG3有潜在的抑制肿瘤细胞生长的功能。在肝癌组织和肝癌细胞株中，MEG3表达缺失或呈极低表达。Braconi等将MEG3转染至肝癌细胞并增强表达，发现肝癌细胞生长受到明显抑制，MEG3能诱导肝癌细胞凋亡；在肝癌细胞中MEG3启动子呈过度甲基化，抑制其甲基化能增强MEG3的表达，说明MEG3在肿瘤组织和细胞中的失活机制与调节区域的甲基化有关。

针对lncRNA与microRNA在肿瘤细胞中的关系的研究逐渐引起国内外学者的重视，前面提到H19是microRNA675的前体，二者能共同影响肿瘤的发生，H19的表达缺失能致使肝癌早发、结肠息肉增殖以及肠癌细胞高致瘤性。H19的致癌与抑癌功能可能与lncRNA的双官能团特性或细胞内环境有关。而MEG3序列的最后一个内含子能够编码microRNA770，microRNA770存在多个microRNA靶点，提示MEG3与microRNA770在基因调控具有潜在关联性。Braconi等的研究结果表明：microRNA29a能够调控与MEG3甲基化抑制相关的DNMT，microRNA29的过度表达能够上调MEG3在肝癌细胞中的表达。

6 LncRNA与肝癌的诊断和预后

LncRNA作为特异性标记分子对肿瘤患者病情进展的评估及预后诊断具有重要临床意义，目前已有关于microRNA作为肝癌的标记分子的深入报道，而对lncRNA在肿瘤的诊断和治疗方面的研究尚待深入。LncRNA在肿瘤中的差异性表达提示其具有潜在的肿瘤进展、预后评估功能；随着lncRNA在肿瘤中的调控机制不断揭示，其对肿瘤发生、发展的促进或抑制特性以及与microRNA、编码基因的协同效应预示着lncRNA在肿瘤靶向治疗上具有极其重要的意义。HULC是原发性肝癌和继发性肝癌特异性表达的lncRNA，除了在肝癌组织和细胞中呈高表达外，Panzitt等通过常规PCR技术在肝癌患者的外周血单核细胞中检测到HULC的表达。这提示lncRNA可作为诊断肝癌的特异性肿瘤标志物。T-UCR是在众多肿瘤中表达的具有高度保守特性的一类lncRNA的总称，其不同片段的异常转录和表达能有助于判断肿瘤的类别和患者的预后：uc.338在人肝癌组织和细胞株中呈特异性高表达；uc.73A在结肠癌中表达显著增高；uc.160、uc.283、uc.346在乳腺癌、肺癌、淋巴瘤、白血病等不同程度表达与肿瘤患者的转移、预后相关。

7 结语

尽管lncRNA对基因调节的重要作用在近10年的研究中已屡见报道，但非编码基因序列中究竟哪一部分发挥作用并决定lncRNA在不同生物进程中的角色，目前仍不清楚；lncRNA的变异和错调是通过何种机制影响肿瘤的发生也少有报道。由于lncRNA在肝癌中分子调控的机制研究十分有限，进一步深入探讨研究lncRNA及其与microRNA和靶基因在肝癌发生、发展和转移中的相互作用，将对发现新的肝癌特异性分子标志物和肝癌治疗的新靶点有重要的理论和实践意义。