结直肠癌的外科治疗亚洲视角优化与标准化 - 3 结直肠癌的分子基础：肿瘤生物学

概要

结肠直肠癌在分子癌发生和形态学多步途径方面是异质性的疾病实体。已经鉴定了三种分子致癌途径：（1）染色体不稳定性（CIN），（2）微卫星不稳定性（MSI），和（3）CpG岛甲基化表型（CIMP）。两个形态逻辑多步途径是经典途径（所谓的腺瘤 - 癌序列）和锯齿状瘤形成途径。 CRC仍然是一个重要的公共卫生问题，转移性CRC的5年预后不到10％。作者对CRC致癌作用的分子事件有了更多的了解，这将有助于开发新的靶向治疗方法，并确定可以有效使用的临床生物标记物。

关键词

结直肠癌•肿瘤生物学•分子致癌作用•MSI•CIN•CIMP•锯齿状肿瘤

3.1简介

结直肠癌（CRC）现在是亚洲男性和女性中第三大最常见的恶性疾病[1,2]。虽然早期检测方面的改进有助于降低过去几十年CRC相关死亡的发生率，但由于其与西式饮食，健康和慢性病有关，因此疾病的整体频率可能会稳步增加。炎症（即炎症性肠病）。因此，寻找新的和有效的CRC治疗方法是为了确定疾病的分子病因。

在上个世纪，CRC遗传学从一个未被认识的领域出现了一个特殊化的领域，涵盖了癌症护理的各个方面。遗传学在CRC中的作用已成为疾病预防，早期发现和有效治疗的关键。当作者进入后基因组时代时，可能已经鉴定出以有意义的方式促成CRC的大多数基因，并因此使CRC成为可预防的疾病。利用广泛的突变信息来建立新的治疗策略需要功能基因组学，医学化学以及临床前和临床工作的组合。

3.2三种分子致癌途径和两种形态学多步途径

就分子癌发生和形态学多步途径而言，结直肠癌是一种异质性疾病实体[3]。已经鉴定出三种分子致癌途径[4] :( 1）染色体不稳定性（CIN），（2）微卫星不稳定性（MSI），和（3）CpG岛甲基化表型（CIMP）。两种形态学多步途径是经典途径（所谓的腺瘤 - 癌序列）和锯齿状瘤形成途径（参见图3.1）。 CIN途径的特征在于染色体数量和结构的改变以及原癌基因和肿瘤抑制基因的伴随遗传突变。 MSI途径的特征在于位于外显子中的核苷酸重复数目的改变以及肿瘤抑制基因或肿瘤相关基因中随后的移码突变。 CIMP途径的特征在于许多启动子CpG岛基因座的广泛超甲基化以及随后肿瘤抑制基因或肿瘤相关基因的失活。经典途径始于包含常规腺瘤的癌前病变，包括管状或管状腺瘤，而锯齿状瘤形成途径始于增生性息肉或无柄或传统的锯齿状腺瘤。这两种形态学路径由不同的分子途径驱动：经典途径由CIN或MSI驱动，而锯齿状瘤形成途径具有表观遗传不稳定性作为其初始驱动力，MSI作为任选的次要力。虽然Lynch综合征CRC和散发性MSI高（MSI-H）CRC都具有高水平的MSI，但它们的癌前病变是不同的，因为它们通过不同的形态学多路径途径发展：Lynch综合征肿瘤遵循经典途径并显示其prema - 作为管状或管状绒毛状腺瘤的恶性病变[5,6]，而散发性MSI-H CRC的癌前病变是通过锯齿状瘤形成途径产生的无柄锯齿状腺瘤，并经历进一步的高甲基化 - 与MLH1相关的失活和随后收购高级MSI [7]。癌症基因组图谱研究结果表明，CIN和MSI途径是相互排斥的[8]。鉴于CIMP途径与MSI途径重叠，因为存在通常也是高CIMP（CIMP-H）的自发性MSI-H CRC，CIMP途径似乎与CIN途径没有排他性关系。 。 CIMP-H /非MSI-H CRC在基因组中显示一些拷贝数变异，尽管CIN的程度不如CIMP阴性或CIMP-低（CIMP-0，CIMP-L）/非MSI-H CRC [9]。这一发现表明，CIMP途径本身可能不足以进行血清息肉的恶性转化，并需要与CIN或MSI途径协作以促进成功的恶性转化。


图3.1两种形态学多步途径：传统途径和锯齿状瘤形成途径

锯齿状息肉的表型变化相当，实体混合息肉反映了这些病变之间相当大的重叠[10]。无柄锯齿状腺瘤/息肉（SSA / P）占所有锯齿状息肉的约20％，并且在形态学上由锯齿状隐窝的延长和增生区的扭曲来定义[11]。 SSA / P的进展与细胞学异常增生的发生和侵袭性腺癌的发展有关。 SSA / P和相关的腺癌优先在右半结肠中发现。传统锯齿状腺瘤（TSA）是血清级腺瘤的形态学变异，与SSA / P有关突变（KRAS突变约25％），定位（左侧）和甲基化状态（增加）有显著差异。甲基化，但不是甲基化MLH1）[12]。

鉴于锯齿状pol-yps的恶性潜能，结直肠癌发生的两个重要的锯齿状通路被表征：（1）无柄ser级通路和（2）传统锯齿通路。由此产生的锯齿状腺癌与SSA / P具有结构相似性，可能伴随其他形态学特征，包括小梁和粘液区。然而，这些CRC可能具有MSI-L或MSI-H，BRAF或KRAS突变，以及CIMP [10,13]。鉴于锯齿状腺癌的分子异质性，目前尚未建立起强烈的基因型与表型关系。

CIN的分子机制包括染色体分离缺陷，中心功能障碍，端粒功能障碍，杂合性缺失和DNA损伤反应缺乏。

3.3.1染色体分离的缺陷

染色体分离缺陷包括染色体重排，序列改变，染色体数目改变和染色体错误分离。 CIN表型可以由调节染色体分离的途径缺陷引起。有丝分裂或纺锤体检查点通过延迟中期到后期的转变来确保正确的染色体分离，直到所有重复的染色单体对在主轴上正确对齐。编码作为纺锤体检查点调节剂的蛋白质的基因包括有丝分裂停滞缺陷型（MAD1L1和MAD2L1），由苯并咪唑1（BUB1）和驱动蛋白家族成员11（KIF11）不受抑制的出芽。 BUB1的突变导致染色体表细胞系中异常的纺锤体检查点和CIN [14]。来自显性阴性mBub1突变小鼠的细胞表现出逃避细胞凋亡，持续的细胞周期进展和破坏的纺锤体[15]。驱动蛋白纺锤体蛋白，也称为Eg5，是在有丝分裂期间负责有丝分裂纺锤体形成和染色体分离的运动蛋白。小鼠中Eg5的过度表达导致梭形缺损，CIN和实体肿瘤形成[16]。由于有丝分裂检查点缺陷导致的染色体错误分离可能导致非整倍性。在促进染色体错误分离和非整倍性后，非整倍性使基因组不稳定，产生多克隆突变，并导致异质核型[16,17]。

3.3.2着丝粒功能障碍

另一个提出CIN的原因是异常的中心数和功能。当中心体被排列成有丝分裂的纺锤体装置时，中心体用于锚定细胞质微管。癌细胞系中的额外中心可能导致有丝分裂过程中多个纺锤体极的形成，导致染色体和CIN的分布不均[18]。 Polo样激酶（Plk）是丝氨酸/苏氨酸激酶，其调节中心体重复。在73％的CRC中观察到Plk1的表达升高，并且与肿瘤侵袭，淋巴结受累和分期相关[19]。中心体相关的Aurora A蛋白在CRC中被扩增并与CIN正相关，但具有增加的Aurora A基因拷贝数的转移性CRC患者具有更长的总体和无进展存活，特别是在KRAS野生型肿瘤中[20,21]。相关的Aurora B蛋白调节染色单体分离，其表达与CRC的晚期相关[22]。

3.3.3端粒功能障碍

CIN也可能由端粒功能障碍驱动。端粒是六聚体DNA重复序列（人类中的TTAGGG），其保护真核染色体的末端在分离期间免于融合和破坏。由于DNA聚合酶不能完全同源化染色体的3'末端，每轮DNA复制后一部分端粒DNA丢失。具有足够缩短的端粒的细胞通过DNA损伤检查点靶向衰老和凋亡。在检查点存活的细胞激活端粒酶，端粒酶延长端粒。

3.3.4杂合性缺失（LOH）

LOH是CIN阳性肿瘤的关键特征，并且区分由CIN途径引起的肿瘤与由MSI途径产生的肿瘤。肿瘤中大约有25-30％的等位基因丢失[23,24]。有丝分裂不分离，同源染色体之间的重组和染色体缺失是其中的重要机制。一项研究发现，18号染色体上的大部分损失涉及整个染色体，并且是由有丝分裂不分离引起的。限于染色体一部分的损失被认为是由于染色体间重组和与DNA双链断裂相关的缺失[25]。

3.3.5 DNA损伤反应的缺陷

DNA损伤反应的缺陷与人类癌症有关。共济失调毛细血管扩张症（ATM）和共济失调性毛细血管扩张症和Rad3相关（ATR）蛋白激酶的失活突变分别导致共济失调性毛细血管扩张和Seckel综合征[26]。与受损的DNA损伤反应相关的其他综合征包括Li-Fraumeni综合征（TP53突变）和遗传性乳腺 - 卵巢癌（BRCA1和BRCA2突变）。在这些基因中，只有TP53直接与人结肠直肠癌有关。组蛋白H2AX（ATM和ATR底物）的单倍体效率导致p53缺陷背景下的基因组不稳定性和肿瘤易感性，来自ATM和H2Ax缺陷小鼠的小鼠胚胎成纤维细胞显示出严重的基因组不稳定性[27-29]。 。缺乏Chk1，DNA损伤检查点蛋白，导致有丝分裂缺陷并在有丝分裂期间破坏Aurora B，导致胞质分裂失败和多核化[30]。

3.3.6 CIN的临床意义

通过测序分析鉴定的许多基因已经众所周知在CRC中体细胞突变（例如，APC，KRAS和TP53）（表3.1）。作者对CRC遗传基础的深入了解可以鉴定出预后的分子标记。与野生型患者相比，激活KRAS和BRAF突变的患者总体生存结果可能更差[31-33]。携带KRAS和PIK3CA突变的肿瘤患者比野生型患者更容易发生肝转移[34]。 TP53突变可能与更高的死亡率相关，但这种风险可能仅限于患有转移性疾病的患者[35,36]。关于染色体18q的缺失是否与不良结果相关联，有相互矛盾的报道;个体染色体缺失当前被用作CRC预后的分子标志物[37-39]。

表3.1与结肠直肠癌发生有关的致癌基因和肿瘤抑制基因的体细胞突变


多年来对CRC分子机制的研究正逐渐转化为临床。患有KRAS突变肿瘤的患者对EGFR的抑制没有明显的反应;因此，西妥昔单抗等药物的使用仅限于患有KRAS野生型癌症的患者[40]。最近的一期临床试验检查了BRF蛋白的特异性抑制剂vemurafenib治疗BRAF CRC，并证实了混合结果，这表明存在主要的耐药机制[41]。 PI3K和下游mTOR途径的抑制已经在PIK3CA野生型CRC的小鼠模型中显示出功效，并且计划进行I期临床试验[42]。 Aurora激酶，Plks和主轴运动蛋白Eg5的小分子抑制剂在临床前研究中显示出前景，并且在I期人体试验中证明了安全性和抗肿瘤效力[43-45]。

与CIN相关的CRC证明没有特征性的组织形态学模式。它们在肿瘤分级，坏死的发生和细胞外粘蛋白的积累方面不同。迄今为止尚未确定用于CRC的内部表型的推定的分子建立者事件/突变。

3.4 MSI

微卫星不稳定性（MSI）是由DNA错配修复（MMR）受损导致的遗传超突变性的条件。 MSI的存在代表了MMR不能正常运作的表型证据。

MMR纠正DNA复制过程中自发发生的错误，例如单碱基错配或短插入和缺失。参与MMR的蛋白质通过形成与DNA错配部分结合的复合物来纠正聚合酶错误，消除错误，并在其位置插入正确的序列[46]。具有异常功能的MMR的细胞不能纠正DNA复制过程中发生的错误并随后累积错误。这导致了新型微卫星片段的产生。基于PCR的分析可以揭示这些新型微卫星，并为MSI的存在提供证据（图3.2）。

微卫星是重复的DNA序列。这些序列可以由长度为1-6个碱基对的重复单元构成。虽然这些微卫星的长度在人与人之间是高度变化的，并且有助于个体DNA“指纹”，但每个人都具有一定长度的微卫星。人类中最常见的微卫星是核苷酸C和A的二核苷酸重复，其在整个基因组中发生数万次。

MSI存在于多达15％的散发性CRC和几乎所有Lynch综合征相关的CRC中，这是由于两个等位基因的体细胞失活或一个等位基因的遗传种系突变以及另一个的另一个体细胞失活[47]。错配修复功能通常可纠正DNA复制过程中的缺失/插入错误。在MSI中，不会形成导致不同长度的等位基因的序列校正。使用共有引物组，基于PCR的策略可以诊断长度差异。在用于MSI测试的标准化组中，使用了两种单核苷酸（BAT25和BAT26）和三种二核苷酸微卫星（D5S346，D2S123，D17S250）[48]。 MSI CRC通常不与KRAS或TP53的突变相关。然而，含有简单重复序列的基因如EGFR，BAX和TGFbetaRII经常在这些肿瘤中发生突变。 BRAF状态是MSI CRC中的另一个变量，也是一个预测因素。 MSI和非突变BRAF患者的无病生存率和总生存率显著提高[49]。 MSI CRC没有染色体异常。

3.4.1 MSI的临床意义

MSI因其在II期结肠癌中的高频率而得到充分认可，其中15％的病例总体和约25％的右侧肿瘤存在，而III期结肠癌的发生率为14％，转移性疾病的发生率为4％。 [50]。错配修复蛋白是复制后新合成的DNA链的监测所必需的，它们用于识别错配的碱基，小插入和DNA聚合酶掺入的缺失[51]。错配修复基因MLH1，MSH2，MSH6或PMS2的种系突变导致Lynch综合征（也称为遗传性非结肠癌 - 结肠直肠癌 -  HNPCC），与早发性结肠和子宫内膜癌相关，除了肿瘤之外。卵巢，胃，小肠，胰腺和其他部位[52,53]。散发性结肠癌中的错配修复功能缺陷通常是由于MSH6和MSH2的突变或MLH1通过启动子甲基化的表观遗传沉默[54]。在遗传性和散发性肿瘤中，异常的错配修复功能导致无法修复微卫星上DNA聚合酶滑动引起的缺陷 - 短串联DNA重复和点突变，导致微卫星不稳定性的特征性分子表型（MSI） ）肿瘤的突变抑制TGFβR2，IGF2R，BAX和PTEN以及致癌基因BRAF [54-57]。 MSI高肿瘤通常接近脾曲和低分化，并表现出明显的淋巴细胞浸润[54]。肿瘤微卫星不稳定性的确认可以使用PCR进行 - 通过显示所检查的五个微卫星标记中至少两个的不稳定性 - 或通过免疫组织化学（IHC）进行错配修复蛋白，因为缺失染色显示出优异的一致性。 MSI高状态[58,59]。建议对II期结肠癌，尤其是T3肿瘤中的MSI进行测试，因为它具有重要的预后和治疗意义，如下所述。


图3.2染色体不稳定性和微卫星不稳定性

3.5 CIMP

与来自Lynch综合征的结肠直肠肿瘤不同，通过涉及CIMP的机制产生具有MSI的散发性CRC。 CIMP最初与MSI肿瘤组合在一起。这些岛是基因组内富含CpG的区域，特别是在启动子序列中发现。在CpG二核苷酸的背景下，胞嘧啶的DNA甲基化是表观基因控制的中心机制，在基因组完整性，基因组印记，转录调控和发育过程中具有重要作用[60,61]。

全基因组甲基化组分析在CRC中具有高亮度的DNA甲基化破坏。肿瘤通常以甲基化（低甲基化）的全局性丧失为特征，主要在重复序列中，以及CpG岛中甲基化（高甲基化）的焦点增加，后者通常同时在限定的兆碱基区域内发生[62-64]。 CpG岛内的超甲基化与肿瘤抑制基因的转录沉默相关，而基因体内的低甲基化可影响转录延伸或替代促进因子的使用并引起癌基因的异常转录[65-79]。全球甲基化损失可能引发癌症基因组不稳定以及重复序列区域内转座子和基因的活化[69-71]。低甲基化和高甲基化都发生在肿瘤发生的早期[72-79]，平均CRC基因组携带数千个甲基化变化，对细胞转录程序有显著影响[80-82]。

经常受这种非共价表观遗传修饰影响的基因是p16，MGMT和hMLH1。 CIMP的存在和程度已被用于将CRC分为三个主要亚组：CIMP高（CIMP-H），CIMP低（CIMP-L）和非CIMP（CIMP-0），具有独特的临床和分子特征（201,202）。 CIMP-H与近端肿瘤定位，女性性别，BRAF突变，MLH1甲基化和MSI有关; CIMP-L的特征是近端肿瘤位置和KRAS突变，而CIMP-0与远端肿瘤位置，TP53突变和CIN相关[32,83,84]。

3.5.1 CIMP的临床意义

临床上，CIMP CRC通常位于近端位置，并且通常具有hMLH1错配修复基因的甲基化。然而，超过50％的CIMP CRC是微卫星稳定的。通常，CIMP CRC预后不良并且与KRAS和/或BRAF的突变相关。 CIMP CRC的组织学表型没有很好地表征或定义。在这些癌症中，经常发现不良程度的组织形态学差异反映了MSI的某些方面。然而，尽管hMLH1错配修复基因的甲基化，组织形态学MSI相关的组织学特征 - 在CIMP CRC中没有完全表达[85,86]。

研究已经确定了一个特别广泛的启动子超甲基化的CRC子集，称为CpG岛甲基化表型（CIMP）[85,87]。在约30％的CRC中观察到CIMP，并且已经使用CIMP的存在和程度将CRC分类为三个主要亚组：CIMP高（CIMP-H），CIMP低（CIMP-L）和非CIMP（CIMP） -0），具有独特的临床和分子特征[82,88]。 CIMP-H与近端肿瘤位置，女性，BRAF突变，MLH1甲基化和MSI有关; CIMP-L的特征是近端肿瘤位置和KRAS突变，而CIMP-0与远端肿瘤位置，TP53突变和CIN相关[32,82-84]。

异常的DNA甲基化模式是有吸引力的肿瘤生物标志物，因为它们在肿瘤中的频率很高，并且从粪便和/或血液中分离的DNA中甲基化的检测已经成为早期诊断和监测CRC的有希望的方法[89,90]。基于微阵列的CRC和良性腺瘤中高甲基化CpG位点的研究揭示了大量肿瘤特异性候选检测标记[91-93]。学术界和工业界正在积极地将这些候选者翻译成基于血液或粪便的诊断测试，涉及方法开发，对正常组织和其他病理学的特异性验证，以及针对常规临床测定的性能评估（FOBT， CEA）。

3.6共识分子亚型

CRC子类型联盟（CRCSC）的成立是为了评估现有基因表达式CRC子类型算法中核心亚型模式的存在与否[94]。总结了具有显著特征的四种共识分子亚型（CMS）：

CMS1（MSI免疫，14％），高度突变，微卫星不稳定，强免疫激活，右侧肿瘤，诊断年龄较大，女性，高变，BRAF突变和中度生存

CMS2（规范，37％），上皮，染色体不稳定，标记WNT和MYC信号传导激活，MSS，左侧肿瘤，TP53突变，EGFR扩增/过表达，以及更好的存活CMS3（代谢，13％），上皮，明显的代谢异常失调，低CIN，中度WNT / MYC途径激活，KRAS突变，PIK3CA突变，IGFBP2过度表达和中间存活CMS4（间充质，23％），突出的转化生长因子β激活，基质侵袭和血管生成，CIN / MSI异源，间充质/ TGF-β激活，诊断时年龄较小，NOTCH3 / VEGFR2过表达，生存率较低。

这些CRC的分子亚型解决了所报道的基于基因表达的CRC分类之间的不一致性并促进了临床翻译。

结论

CRC继续成为重大的公共卫生负担。尽管在靶向治疗的发展方面取得了显著进展，但转移性CRC的5年预后仍然不到10％。然而，作者对CRC癌症发生的分子事件的了解日益增加，这将有助于开发新的靶向治疗方法，并确定临床生物标志物，从而为其有效使用提供依据。这是癌症医学的激动人心的时刻，作者相信该领域有望取得重大的治疗突破。

基因组方法的应用，特别是整个外显子组测序，提出了超出评估与患者CRC原始预先发生相关的分子改变的问题。鉴于这些测试的综合性质，可以对基因的临床相关变体进行偶然发现，而不与初步诊断相关。基因组技术的革命性进步正在为CRC提供人员化医疗的可能性。不断发展的平台，如下一代测序（NGS）和高密度微阵列 - 正在开始以合理的成本为诊所提供精确的基因组分析。现有应用和临床信息学算法以及许多新兴技术的持续创新将继续推进转化癌症基因组学，并最终有助于改善患者的治疗效果。

参考：Surgical Treatment of Colorectal Cancer Asian Perspectives on Optimization and Standardization