耳、鼻、喉和鼻窦感染 - 3 生物膜在上呼吸道感染中的作用

图3.1成熟细菌生物膜的结构。 基于Kanaparthy A，Kanaparthy R. Biofilms的图片 - （临床牙髓生物膜）。


图3.2细菌生物膜发育阶段：

（1）自由漂浮细菌的早期和可逆粘附;

（2）晚期和不可逆的粘附与细胞外聚合物的产生;

（3）成熟;

（4）与持续细菌定植有关的浮游菌株的周期性传播，而不是一种独立的毒力因子[10]。

生物膜的发展是一个涉及[5]的多步骤过程（图3.2）：

1.板 - 滋补（自由漂浮）细菌对宿主表面的早期和可逆粘附;

2.通过菌毛和非菌毛粘附素，细菌聚集成微菌落和EPS产生的晚期和不可逆的细菌附着;

3.生物膜生长和逐渐成熟为有组织的结构;

4.浮游生物菌株的周期性扩散，可迅速繁殖和分散，从而导致邻近地区的急性恶化，定植和感染的自我更新。


图3.3通过落射荧光显微镜检查不锈钢表面上的聚合物生物膜。来自Donlan RM。表面的微生物寿命。新出现的传染病2002; 8：881-890，

这些阶段通过N-酰化高丝氨酸内酯的产生来协调，N-酰化高丝氨酸内酯是由生物膜细菌释放到其局部环境中的小的可扩散信号分子，并且以浓度依赖性方式激活群体感应机制[5]。

鉴于其代谢率降低（特别是在核心）和复杂的三维外观，生物膜难以通过传统的染色和培养技术进行研究[12]（图3.3）。通过共聚焦激光扫描显微镜或扫描电子显微镜[13]可以获得对其超微结构和环境的更详细的见解，可能与荧光原位杂交（FISH）结合以检测细菌菌株[14]。更简单和更便宜的分光光度法也被用于通过评估粘附在光滑培养板上的染色生物膜产生细菌的光密度来量化生物膜形成[15]。

根据Parsek和Singh的标准[16]，生物膜相关感染通常由以下因素定义：

1.病原体与表面的关联;

2.基质内的聚集的微生物细胞（微菌落）;

3.局部感染;

4.尽管记录了浮游菌株对同一化合物的易感性，但仍然不愿接受抗生素治疗。

生物膜中的细菌可能难以通过传统培养技术进行培养，这可能导致某些慢性感染中出现错误的阴性培养。如通过与炎性宿主细胞相关的细菌大分子的存在所表明的，生物膜的宿主清除通常是持续但无效的。

生物膜中的细菌显示出对抗生素处理的显著抗性，并且比浮游培养中生长的相同细菌的敏感性低10-1000倍[5]。由于细菌生物膜表现出高度的抗生素抗性并且可以逃避免疫系统，因此它们在各种上呼吸道感染中的作用引起了重要的关注。生物膜可能在复发性急性扁桃体炎，慢性腺样体炎，急性和慢性中耳疾病以及慢性鼻窦炎[17]中发挥作用，作者将讨论该作用和可能的治疗策略。

细菌生物膜和上呼吸道感染

扁桃体炎

生物膜参与病原体发生的观点是基于这样一个事实，即它们已经在患有复发性急性感染和慢性高血压病的患者的扁桃体标本中被发现[18-21]。根据使用的微生物诊断程序，有限病例系列患者报告的扁桃体生物膜的患病率在41％至85％之间，并且在复发性急性扁桃体炎患者中似乎更高[60-85％] [18 -20]比没有复发性感染的慢性扁桃体肥大者（41％）[20]。

革兰氏阳性生物似乎占主导地位[18-20]。与Torretta等人的研究结果相似。 [21]，Al-Mazrou和Al-Khattaf [20]发现金黄色葡萄球菌最常被分离，其次是链球菌属，而Galli等。 [19]报道了相反的情况。斯图德利等人。 [22]已经提出通常与慢性扁桃体炎症[23]相关的扁桃体结石（扁桃体结石）是通过共聚焦显微镜显示的具有异质结构的活性多活性生物膜。

据报道，在患有复发性急性扁桃体炎的儿童中，扁桃体生物膜的存在与Brodsky的扁桃体肥大程度之间存在显著关系[21]。 Torretta等人。评估了22例有复发性急性扁桃体炎病史的儿童扁桃体切除标本，发现50％的生物膜[21]。生物膜的存在与前一年的性别，年龄或急性扁桃体炎发作次数之间没有相关性，但生物膜在3或4级扁桃体肥大儿童的扁桃体上发现的可能性比1级或2级高4倍这种关系可能部分是由于在先前未患有阻塞性增生性扁桃体的儿童[24]和健康患者中也可检测到明显非致病性扁桃体生物膜[25]。因此，大扁桃体和复发性感染性恶化患者的生物膜概率更高。细菌粘附是生物膜开发的第一步，在粘膜损伤的情况下得到增强[26]，因此可以推测，扁桃体表面越大，细菌粘附于扁桃体的风险就越大。隐窝和后续的生物膜生产。

已在健康患者中检测到扁桃体生物膜，但在复发性扁桃体炎患者中似乎存在较高百分比的Tonsillar生物膜。 Woo等人。使用扫描电子显微镜比较来自20例接受扁桃体切除术治疗复发性急性扁桃体炎的患者的扁桃体活检样本与20名对照志愿者（接受喉部活检的患者），并发现80％的急性扁桃体炎组生物膜与45％的对照组相比较小组，一个显著的差异[25]。与对照组相比，生物膜似乎也涉及扁桃体 - 扁桃体组中更多的扁桃体表面。这可能表明，尽管生物膜中的少量细菌可以定殖扁桃体上皮而不会引起感染，但更发达的扁桃体细菌生物膜的存在可导致复发性急性感染。

扁桃体生物膜的存在与呼出的一氧化氮水平增加之间可能存在显著关系[27]。一氧化氮是人体呼吸道自然释放的高反应性介质，可作为炎症的标志物。已经研究了呼出的一氧化氮作为慢性扁桃体病的可能病因，结果相互矛盾[28,29]。 Kasperska-Zajac等。发现复发性扁桃体炎患者的呼出气一氧化氮水平增加[28]，但Torretta等人。没有发现慢性腺样体炎患儿与腺样体扁桃体肥大的比较[29]。然而，当计划用于扁桃体切除术的24名儿童测试呼出的一氧化氮水平时，随后确定患有扁桃体生物膜的患者的平均一氧化氮水平显著高于没有生物膜的患者[27]。生物膜与高呼出气一氧化氮水平之间的关联与一氧化氮介导的细胞间信号传导倾向于生物膜形成，蜂群和扩散的假设是一致的[30,31]。

在这些观察的基础上，一些作者已经测试了对扁桃体生物膜进行可能的医学治疗的有效性[32,33]。 Bulut等人。 [32]最近记录了将N-乙酰半胱氨酸和乙酰基 - 环丙烯酸应用于从10名接受扁桃体切除术治疗复发性急性感染的患者的扁桃体样本中生物膜厚度的显著减少，其中乙酰水杨酸的剂量为 - 有关。其他研究表明，体外透明质酸（许多细胞外基质中普遍存在的成分）可作为抗粘附和抗生物膜分子在暴露于上呼吸道感染患者的细菌物种的Hep-2细胞上发挥作用。 [33]。

然而，鉴于已发表的慢性扁桃体病患者扁桃体表面生物膜形成研究的缺乏，仍然缺乏有关扁桃体生物膜参与复发性急性扁桃体炎发展的强有力证据，特别是因为在45％的健康病例中发现了生物膜[25]。目前尚无明确的结论，需要更大规模的对照研究来确定生物膜和抗生物膜治疗策略在慢性扁桃体病中的作用。

慢性腺样体炎和中耳炎

生物膜被认为与慢性腺样体炎和慢性或复发性中耳疾病的发病有关，因为腺体和周围的鼻咽似乎充当抗性多微生物生物膜的储库（主要由耳致病菌流感嗜血杆菌，粘膜炎莫拉氏菌产生）和肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）定期释放浮游物种，这些物种通过咽鼓管引起局部感染性恶化和中耳定植[34-39]。这一假设得到了电子显微镜检查结果的支持，这表明生物膜的存在几乎覆盖了复发性急性中耳炎（RAOM）患儿的腺样体粘膜表面[34,35]，并报道了耳致病的生物膜的检测在复发性中耳感染患者的中耳样本中[37]。总之，这些发现表明鼻咽和中耳定植菌株之间具有良好的相关性。

尤其是Zuliani等人。 [40]表明，有严重RAOM病史的儿童（6个月内发作4次，12个月内发生6次）的腺样体生物膜明显多于阻塞性睡眠呼吸暂停综合征与中耳感染无关的儿童，并且从RAOM患者中去除腺样体的粘膜表面的平均93.5％被生物膜覆盖，而阻塞性睡眠呼吸暂停综合征患者中去除的腺样体表面积的1.0％。

在患有持续性中耳炎（OME）的患者中也发现了生物膜，由于病原体不能通过传统的文化技术检测到，因此通常认为它们具有细菌学上的无菌性。然而，细菌DNA已通过聚合酶链反应（PCR）测试OME患者的中耳积液来检测[41]，中耳细菌mRNA的发现表明存在复制细菌[42]。在患有持续性OME的患者的中耳粘膜中由耳致病菌产生的生物膜的发现并不令人惊讶：通过扫描电子显微镜或共聚焦激光扫描显微镜发现生物膜在40-92％的中耳样本中取自儿童与OME [42,43]。然而，腺样体生物膜与持续性OME之间的关联是值得怀疑的：一些作者[39,44]发现持续性OME患者的腺样体组织比对照组具有更大的生物膜形成，但是Hoa等人。 [45]发现只有28％的持续性OME患者存在鼻咽表面生物膜，但99％的RAOM患者。

作者通过在鼻咽圆顶上进行腺样体活检，研究了与RAOM和/或持续性OME相关的慢性腺样体炎患儿中生物膜产生菌的流行率，菌株或生物膜生产能力是否存在差异。并且靠近咽鼓管的咽口[34]。生殖膜在咽鼓管口附近的腺样体表面上比在鼻咽穹隆处更频繁（72.2％对53.3％），但是，尽管金黄色葡萄球菌在鼻咽穹隆和肺炎链球菌和粘膜炎莫拉氏菌中更为普遍。在咽鼓管附近经常检测到，差异无统计学意义。这些研究结果表明，肥大性腺体（尤其是接近咽鼓管口时）是生物膜的储库，负责细菌菌株的周期性扩散及其对咽鼓管和中耳的定植，从而表明应完全去除腺样体，以确保完全根除腺样体生物膜。

作者还发现，与对照组相比，产生鼻咽生物膜的耳部病原体在患有RAOM但没有腺样体超级奖杯的年轻儿童中更为普遍，这表明鼻咽生物膜本身在复发性中耳的发病机制中发挥作用。感染[35]。流感嗜血杆菌是参与RAOM儿童生物膜形成的主要病原体，从而证实其在复发性中耳感染中的作用[35]。

生物膜也可能参与慢性化脓性中耳炎（CSOM）和与胆总管相关的慢性中耳炎的发展[37,38,42,45-48]，特别是由金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌产生的生物膜[37] ]。特别是，从CSOM患者中采集的样本中有43-92％发现了生物膜[37,46-48]，而从患有胆脂瘤的慢性中耳炎患者中采集的样本中发现了75-85％的生物膜[36，46,48]。

最后，从患有急性中耳炎的儿童中分离的临床上不可分型的流感嗜血杆菌形成生物膜的发现[49]导致了生物膜可能参与急性中耳感染的假设。当细菌处于有利的环境中时，细菌只需几分钟即可开始生物膜生产[38]，这可能是急性中耳炎对抗生素反应失败的原因。然而，Mizrahi等人最近质疑了这一假设。 [50]，他们没有发现急性中耳炎中不可分型的流感嗜血杆菌生物膜形成与治疗失败或疾病复发之间存在任何关联。

这些研究结果表明，耳聋基因产生的鼻咽和中耳生物膜可能在慢性腺瘤，RAOM和OME中起到致病作用，并支持金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌产生的中耳生物膜在发育中的作用。 CSOM和与胆脂瘤相关的慢性中耳炎。

鼻窦炎

一些作者假设多微生物生物膜与复发性或复发性慢性鼻 - 鼻窦炎（CRS）之间有或没有鼻息肉的关系，但各种研究的结果相互矛盾[51-63]。生物膜已被检测到25％-1％的CRS患者样本[51-56]，尽管大多数研究已在超过70％的CRS患者中记录了生物膜。一些作者认为生物膜在鼻息肉患者中可能更为普遍（97％），而在没有鼻息肉的患者中则更为普遍（56％）[56]。检测率之间的差异归因于所考虑的群体的差异，仅使用粘膜表面的一小部分的活检标本，以及微生物诊断技术的差异[54]。

腺样体作为生物膜储库的作用已经在患有顽固性鼻 - 鼻窦炎的儿科患者中得到证实。 Coticchia等。 [57,58]发现从患有CRS的儿童中去除的约95％的腺样体粘膜表面覆盖有生物膜，而从患有阻塞性睡眠呼吸暂停综合征的儿童中去除的腺样体表面仅约2％。

另一方面，发现许多接受鼻腔手术治疗与慢性鼻窦炎症无关的疾病的患者在健康的鼻粘膜表面有生物膜[59,60]，这表明存在共生生物膜，可以 被认为是一种呼吸道粘膜毯[53,61]。 Dlugaszewska等。 [59]最近记录了45％的对照样品中存在生物膜，因此建议应重新考虑生物膜在CRS病因学中的作用。

在生物膜相关的CRS病例中检测到的细菌包括金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，凝固酶阴性葡萄球菌，肺炎链球菌，粘膜炎莫拉氏菌，流感嗜血杆菌和真菌物种[62,63]。 Sanderson及其同事使用FISH技术结合共聚焦激光扫描显微镜检测并检测了18名CRS患者中的14名生物膜，但也检测了3名对照患者中的2名[62]。使用FISH检测四种细菌（流感嗜血杆菌，肺炎链球菌，金黄色葡萄球菌，假单胞菌），他们发现流感嗜血杆菌是主要病原体（78％），其中一些是流感嗜血杆菌生物膜还包括其他细菌（肺炎链球菌或金黄色葡萄球菌）。在任何情况下都未检测到假单胞菌。三个对照活组织检查中的两个也具有流感嗜血杆菌生物膜。有趣的是，在本研究中也获得了常规术中培养，这些与FISH测定的结果无关，可能是因为常规培养物检测到浮游细菌，但通常不是生物膜内的细菌。在超过四分之三的生物膜病例中，常规培养物呈阴性或仅生长为凝固酶阴性葡萄球菌（一种定植物）：没有一种培养出流感嗜血杆菌。最近在嗜酸性粒细胞粘蛋白CRS患者中评估了真菌物种的作用，其中真菌超敏反应似乎为嗜酸性粒细胞反应的增加铺平了道路[64]。希利等人。使用泛真菌和细菌FISH探针，发现大多数慢性鼻窦疾病患者的生物膜中都含有真菌和细菌（主要是流感嗜血杆菌）的混合物，但患者生物膜中存在更多真菌的趋势。与CRS患者相比，嗜酸性粒细胞粘蛋白CRS和过敏性真菌性鼻窦炎[64]。 Boase等人。使用动物模型（绵羊）研究鼻窦真菌生物膜，并在一些病例中用真菌（曲霉菌或链格孢属）和金黄色葡萄球菌接种封闭的额窦[65]。有趣的是，真菌生物膜在80％的鼻窦中形成，这些鼻窦共同接种了金黄色葡萄球菌，但只有8％的鼻窦接种了单独的真菌。此外，生物膜相关CRS中真菌物种和金黄色葡萄球菌的同时发现表明它们可能在CRS的发展中起协同作用[65]。由金黄色葡萄球菌产生的生物膜有可能促进EPS内的真菌物质的附着，或者金黄色葡萄球菌以这样的方式损害鼻窦粘膜，从而有利于真菌粘附和随后的生物膜产生。然而，生物膜也可能只是鼻窦粘膜的定植者，而不参与病理过程[64]。

有趣的是，一些作者认为生物膜相关CRS患者可能患有更严重的疾病[54,66]，其症状，临床和放射学结果较差[54-56,67]。特别是，一些研究报道了生物膜患者的Lund-McKay放射学和Kennedy-Lund内镜评分更差[54,66]。LEE等人。 [55]报道鼻窦收缩试验（SNOT 20）症状评分和个体鼻部症状与CRS患者生物膜的存在呈负相关。

一些研究表明生物膜相关CRS中传统治疗的反应比非生物膜病例更差：接受功能性内镜鼻窦手术的生物膜相关CRS患者术后复发率更高，更需要手术翻修[63,67]。接受手术修订的患者比正在接受原发性手术的患者更容易患生物膜，并且鼻腔鼻窦生物膜的存在与之前手术治疗的数量之间存在显著相关性[63]。这可能是由于传染性鼻窦病灶的持续存在或合并的慢性损伤和鼻旁黏膜的炎症，正如一些研究表明，窦生物膜粘附在破坏的呼吸道上皮中会引起更大的免疫反应，而不是浮游细菌定植于鼻腔鼻窦。 上皮 [68]。此外，生物膜可能与更多数量的炎症（主要是嗜酸性粒细胞）细胞相关，并促使宿主的适应性免疫转向Th2-辅助状态，这种状态易发生持续性炎症[69]。

抵抗性

生物膜不仅对宿主免疫反应和抗生素具有极强的抵抗力，而且对非抗生素的化学和物理治疗也有抵抗力。据估计，在上呼吸道感染中，生物膜中的细菌对常规抗生素治疗的耐受性比其相应的浮游菌株高100倍[70-72]。

生物膜中的细菌以各种方式逃避抗菌挑战：核心内代谢静止细菌的低复制率，以及由EPS组成的强烈且连续重塑的外部屏障的存在，这限制了抗生素的渗透和抑制免疫球蛋白，超氧化物和调理素的作用[70-72]。数学模型已经表明，限制性扩散以外的机制（如催化反应）可能是生物膜对抗生素敏感性降低的原因[73]。

虽然EPS不能完全阻止抗生素渗透到生物膜中，但它可能会充分延迟渗透，使基因突变的表达决定了外排泵激活等抗性机制的获得[8]。此外，抗生素耐受性可能是由于在固定相中许多细菌的稀释[74]。

众所周知，生物膜可以逃避免疫作用，正如抗吞噬细胞假说[10]所暗示的那样，白细胞可以穿透通道而不是细菌细胞，它们的运动性和吞噬活性降低，因为生物膜内有限的氧化潜力[75]。此外，活性氧物质在生物膜中的扩散受到生物膜外层快速失活的阻碍，并且IgG的渗透限于EPS的外围[76]。

治疗策略

随着生物膜对常规剂量的全身性抗生素的抗性增加，局部给药可能是优选的，因为它导致靶位点处的高药物浓度，并降低全身副作用的风险。据报道，1000倍浓度的局部抗生素将显著减少从CRS患者手术中分离的金黄色葡萄球菌生物膜中存活的细菌[77]，一些研究表明莫匹罗星鼻腔冲洗（可能与口服强力霉素或甲氧苄氨嘧啶 - 磺胺甲恶唑合用）对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌引起的急性CRS急性加重患者的症状缓解有积极作用[78]。然而，体内模型未发现莫西沙星，环丙沙星和万古霉素对生物膜根除的任何显著影响[77,79,80]，尽管已发现强粘附生物膜对局部给药的高剂量敏感环丙沙星，万古霉素和亚胺培南[77]。

旨在干扰细菌粘附的治疗包括使用受体模拟物或接种疫苗的免疫阻断[53]。群体感应抑制剂（包括亚抑菌浓度的阿奇霉素，克拉霉素，呋喃酮和NVC-422）已经在体外和动物模型中进行了研究[81,82]，结果相互矛盾。塔塔尔等人。 [51]发现用口服克拉霉素治疗8周（500毫克，每日两次，持续2周，然后每天250毫克，持续6周），使内镜鼻窦手术患者体内生物膜的流行率从75％降至44％。这个疗程结束了。然而，没有进行后续研究以评估这些患者中生物膜的复发。

建议的治疗包括持续性或脉冲波超声[83]，稀释婴儿洗发水[84]，用柠檬酸和两性离子表面活性剂[85]洗涤，气流吹扫和冲洗（以消除声音假体中的生物膜） ）[86]和激光产生的冲击波[87]这些提议的许多治疗方法仅用于动物或体外模型。一项体外试验研究发现，与未治疗的对照息肉相比，低频超声完全清除了CRS患者切除的息肉生物膜，并显著降低了粘膜下炎症细胞计数[83]。

其他治疗方案包括麦卢卡蜂蜜（体外和体内测试）[88,89]，益生菌饮料（发酵乳和黄油牛奶）（体外和体内测试）[90,91]，咖啡因（在体外试验）[92]，抗菌漱口液（氯己定，三氯生;洗必泰最少减少牙菌斑）[93]， - 乙酰基水杨酸（体外和体内试验）[32]，呋塞米（体外试验）[94] ，龙胆紫和柠檬酸铁铵（体外试验）[95]。所有这些都已经尝试了相同的结果[32,88-95]。 Kilty等。 [88]报道麦卢卡蜂蜜具有抗生物膜和浮游物种P. 铜绿假单胞菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的体外活性。最近，LEE等人。 [89]报道了一项小型试验的结果，该试验随机选择慢性鼻 - 鼻窦炎患者使用麦卢卡蜂蜜与盐水鼻腔冲洗30天，并根据需要使用抗生素和皮质类固醇。在试验结束时，通过症状（SNOT-22）或内镜鼻窦评分评估的结果没有差异。 Macchi及其同事 - 使用甲砜霉素甘氨酸乙酰半胱氨酸，一种与组织酯酶接触分解为抗生素甲砜霉素（类似于氯霉素）和粘液溶解剂N-乙酰半胱氨酸的化合物，用于治疗102例复发性上呼吸道感染患者，包括一些复发性鼻窦炎[96]。该方案包括第1天的肌内注射，然后在第2-10天进行雾化或局部（鼻部）治疗。 24名患者通过扫描电子显微镜检测到生物膜，其中21名患者在治疗结束后5天进行随访时有细菌学和临床解决方案的证据。然而，鉴于102名患有反复呼吸道感染的患者中仅有24名（包括一些患有致病性疾病）的细菌生物膜，并考虑到短期随访和治疗方案的设计，作者无法得出任何明确的关于甲砜霉素和N-乙酰半胱氨酸治疗与细菌生物膜相关的复发性鼻窦炎的有效性的结论。最近，在实验诱导的额窦葡萄球菌生物膜的绵羊模型中评估了莫匹罗星局部鼻窦冲洗的疗效[97]。特别是，用莫匹罗星定期治疗（12小时窦冲洗5天）显著降低了生物膜表面积，并且这种效果在停止治疗后8天仍然明显。

最后，一些研究人员提出了测试铁螯合剂[98]，分解酶如DNase I和分散素B [99]以及氧化亚氮途径代谢产物的效果[100]。

结论

生物膜在复发性和慢性上气道感染的发病机理中的潜在参与是一个新出现的问题。 然而，尽管进行了广泛的研究，仍然没有明确的证据表明生物膜在上呼吸道感染中起着因果作用。 对生物膜复杂的三维结构以及导致其对免疫系统的抗性以及抗生素和非抗生素治疗的超结构和生化机制缺乏详细的了解。

未来的科学努力应该旨在通过诱导预先存在的生物膜的分散和防止细菌粘附到生物和非生物表面来克服日益增加的治疗失败率。

参考：Infections of the Ears, Nose, Throat, and Sinuses