核酸提取、PCR、荧光定量PCR常见问题解答

1. RNAfixer的工作原理?

浸入组织，抑制RNase的活性。运输方便，是非液氮类的一种样品储存液。

2. 对于内源RNase丰富的组织和样品，如何消除RNase?

可以在提取时候多加裂解液，比如4：1等。

3. TRIpure and RNApure区别?

胍盐类的裂解液一样，RNApure附加有离心柱，和漂洗液，是Kit。TRIpure只是裂解液。

4. 凝血的gDNA和RNA的提取与新鲜血的提取不同?

需加一个分离柱(separate column)分开凝血。

5. MicroRNA提取和定量?

过2次离心柱，得到200 bp一下的小RNA。可以测定OD定量。

6. 血清，血浆，血液RNA提取的区别?以及Viral RNA提取的方法?

液体类样品RNA提取用TRIpure LS。一般血清、血浆是无细胞样品，含游离的RNA，量比较少，建议加Carrier RNA在提取时候。病毒RNA提取最好加Carrier RNA在提取时候，BioTeke有专门的病毒RNA提取试剂盒。

7. 通用植物RNA提取常见问题：蛋白质污染?

DNA污染-DNaseI消化(Kit does not provide it, please get it from other companies.)

8. 真菌RNA提取

可用RNApure 或者通用植物RNA提取Kit。

9. DNA cleanup from gel and PCR, 区别?

胶回收含有一个溶胶液。多功能胶回收可以用于胶回收和PCR产物回收。

10. 土壤DNA提取优点?

无需要机械破碎样品和过柱的纯化方式，减少DNA的锻炼和得率，达到实验目的。

第二部分PCR/RT-PCR常见问题解答

1. 二次PCR无目标产物，电泳孔道亮?

Template稀释和重新设计引物

2. microRNA的反转录问题?

microRNA反转录和普通的mRNA的反转录不一样。现在常见的microRNA反转录引物有2种，一个是step-loop结构;另外一种是3末端加polyA后，再用oligo(dT)逆转录。BioTeke有microRNA提取和2-step real-time PCR Kit。

3. cDNA的合成(RT)电泳，以及cDNA第二链的合成问题?

2-5uLcDNA产物电泳有模糊条带出现。第二链合成也有专门的试剂盒。BioTeke现在没有此类产品。

4. Power Mix扩增不成功因素?

产品或者引物或者目的基因的不表达。

5. RT-PCR没有扩增产物?

可能是引物，模版，产品等。

第三部分Real-time qPCR 常见问题分析

1. 做标准曲线时候，可否用2个不同体系浓度的稀释分别对于内参和目的基因?

建议最好用同样稀释倍数做曲线，因为模板浓度会影响扩增效率。

2. 熔解曲线中，Tm不出现在80度左右?

扩增片段100 bp左右的，一般应该出现在80度左右。如果低于此温度出现，可能是模板降解。

3. 扩增曲线没有Ct值，仅仅一条斜线?什么原因?

模板浓度过低或者模板降解。

4. 如果内参和目标基因表达量差别比较大，也就是目的基因的表达量少，Ctcon=15，Cttarget=38，可否应用?

可以用于数据分析。因为表达量低，从而用过高模板进行扩增，从而同内标的模板不同，反而会增大数据统计的误差。

5. 引物浓度可否是50nM，是否太低?

如果扩增曲线和熔解曲线比较好，这个浓度当然可以。如果更低，扩增结果好的情况下，同样可以运用。一句话，所有的模板、引物等浓度尽量不要用高的，会影响扩增效率。

6. miRNA多个扩增时候，如果一个的扩增效果比较，其它熔解曲线不止一个峰，如何解决?

Primer对于miRNA是专一的。所以重新设计引物是不可取的。那么只能是提高Tm或者更换mastermix等。反应体系会影响反应产物的。

7. 相对定量方法，如果用Ct值比较，是各个样品平均后在2delt Ct还是分别2 delt Ct在平均比较好?

相对定量的方法各有优缺点，主要取决于实验的目的和材料的准备。如果是材料群体个体差异不大，这2种方法基本没有很大的区别;如果是个体差异比较大，建议用双标准曲线做。就是分别做内参和目的基因的标准曲线，分别带入Ct值计算。

8. 熔解程序可否不加?

如果是扩增效果好，特异扩增，可以不加熔解程序;但建议做好加上。

9. 扩增反应体系5uL，扩增效率低，什么原因?

反应体系小，各种因素的影响比较大，比如引物浓度、模板浓度及其金属离子等会影响扩增效率的。

10. 如何减少非特异性扩增的干扰?

设计一对好引物，提高primer的退火温度，以及设定吸光温度。