肝细胞癌组织中抑癌基因NPRL2的表达及其意义

肝细胞癌（HCC）为原发性肝癌，其发生、发展是由于环境、遗传和生活环境等因素通过不同的途径激活原癌基因、抑制抑癌基因导致细胞增殖和凋亡失调所致。NPRL2（nitrogen permease regulator-like 2）是新发现的人抑癌基因，位于人基因组3p21.3区域。它通过多个途径抑制肿瘤的形成，而其失活与多种肿瘤的发生，发展密切相关。其表达量与癌组织大小、血清人凝血酶原前体蛋白（PIVKA-Ⅱ）水平密切相关啪。本研究选取肝癌组织及其配对正常肝组织，应用实时荧光定量PCR法、免疫组织化学方法检测NPRL2mRNA和蛋白的表达情况，探讨其与肝癌临床病理特征的关系，了解NPRL2基因在原发性肝癌发生、发展中的作用，为肝癌的临床诊断和预后判断提供新的线索。

一、资料与方法

1.标本收集：收集本院2008年12月至2009年4月手术切除HCC组织标本和配对的正常肝组织各60例。肝癌患者年龄32～64岁，平均年龄53 （53.0±0.8）岁。按照病理学分型，其中巨块型22例，结节型33例，弥漫型5例，每例均作TNM分期，所有患者术前均未接受过放射治疗和化学治疗。选取配对手术切除正常肝组织为对照组。所有标本取部分提取总RNA，其余均用4%多聚甲醛溶液固定后常规石蜡包埋，连续切片。

2.试剂来源：免疫组织化学试剂盒购自上海生工生物工程公司；NPRL2鼠抗人单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，超敏SP试剂盒、DAB均购自上海Genetech公司。Trizol总RNA抽提试剂盒购自上海生工生物工程公司，逆转录酶（MMLV-RT）购自美国Pramega公司，Real-timePCR专用Sybergreen荧光染料购自美国Biorad公司。

3.免疫组织化学法：石蜡切片经脱蜡水化后，采用微波煮沸I5 min以修复抗原，其余步骤按sP试剂盒说明书进行，NPRL2第一抗体工作浓度为1：100，4℃过夜，DAB显色，苏木素复染，梯度乙醇溶液脱水封片。以磷酸盐缓冲液代替第—抗体作阴性对照。

4.实对荧光定量RT-PCR法：按照总RNA抽提试剂盒说明书的步骤对癌变组织和对照组织进行总RNA的抽提，用逆转录酶逆转录mRNA为cDNA。Real-timePCR体系（20μl）为：10×缓冲液2μl、200 mmol/LdNTPs 0.4μl、 25 mmol/L MgCl2 2.4μl、10 mmol/L上游和下游引物各0.5μl、Fermentas Taq DNA聚合酶0.2 μl，0.5 g/ml Sybergreen荧光染料0.3 μl，加双蒸水13.7μl。引物分别为：3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）上游引物：5'-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3'，下游引物：5'-GGCATGGACTGTGGTCATGAG3-3'；NPRL2上游引物：5'-GAGCAGCCCTGGCACTAC-3'，下游引物：5'-GTCTTGCAGCAGATCTCG3'。Real-time PCR条件：NPRL2：95℃3 min；95℃30s，55℃30s，72℃20s，共40个循环；72℃延伸10 min； GAPDH：95℃3 min； 95℃30s，60℃25 s，72℃20 s，共30个循环；72℃延伸10 min。GAPDH标准品连续倍比稀释后与样品同步扩增，得到标准品实时扩增曲线及对数标准曲线。保证每批标准品实肘扩增曲线为一组近似平行的光滑曲线，对数标准曲线相关系数在0.999，否则重复检测。进行三次组内重复后，参照文献用ct（△△CT）值法进行计算，分析癌变组织和对照组织中NPRL2相对于GAPDH表达的相对量。

5.结果判定：（1）免疫组织化学结果：NPRL2蛋白主要表达于肝癌细胞胞质中，呈絮状和团块状分布。按染色强度和阳性细胞比例进行评分，阳性强度：无着色为0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分，阳性细胞比例（面积）：无着色为0分，着色面积＜ 1/3为1分.1/3～2/3为2分，＞ 2/3为3分。两项结果相加≥3分为阳性。（2） Real-time PCR结果：将每一个肿瘤组织样本中NPRL2相对于GAPDH的相对ct值（NPRL2 Ct-GAPDH Ct）即△Ct＞ 6.5视为阴性，其余视为阳性。

6.统计学方法：用SPSS11.5统计软件包进行数据处理，临床病理指标的组间差异采用x2检验；NPRL2相对表达量采用组间t检验法，以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.免疫组织化学检测肝癌组织和正常肝组织中NPRL2的表达：在大部分肝癌组织中都可以看到NPRL2蛋白表达，与正常对照组相比，其表达明显下降。NPRL2蛋白阳性表达率在两组分别为26.7% （9/60）和96.7% （58/60），差异有统计学意义（x2= 81.138，P＜0.01）。

2.肝癌组织和正常对照肝组织中NPRL2 mRNA的表达：肝癌组织中NPRL2 mRNA的表达较正常组织明显下降（2-△△Ct=0.192），两组比较，差异有统计学意义（t=1.413，P＜0.01）。见图1。

表3 NPRL2蛋白及mRNA的表达水平与肝癌TNM分期和淋巴结转移的关系

图1 Realtime PCR检测两种组织中NPRL2 mRNA的相列表达量

3.NPRL2表达与肝癌组织临床病理指标的关系：肝癌组织中NPRL2蛋白和mRNA阳性表达率，在Ⅲ～Ⅳ期较Ⅰ～Ⅱ期低，腹腔或腹膜后淋巴结转移者较无转移者低.NPRL2蛋白阳性表达率与患者年龄无明显相关性。所有样本均包含巨块型肝癌、结节型肝癌和弥漫型肝癌。

三、讨论

与HCC相关癌基因、抑癌基因的异常表达已有很多报道。已有研究结果表明，3号染色体短臂等位基因缺失在恶性肿瘤中频繁出现，提示此区域可能存在对肿瘤发生、发展起重要作用的抑癌基因，Lerman等在肺癌组织中发现在此区域的缺失突变除了RASSFIA基因等，还发现了NPRL2基因。Li等发现NPRL2基因在多种肿瘤组织如肾癌，肺癌和宫颈癌中存在基因突变、3'端缺失等。其中NPRL2基因3'端发生缺失突变后可能影响了细胞DNA错配修复、细胞周期调控以及细胞凋亡水平等。这些研究结果提示，NPRL2基因可能在HCC的发生、发展中起着重要作用。

目前，NPRL2作为一种较新的候选抑癌基因在肝癌组织和正常肝组织中蛋白与mRNA水平表达的差异尚缺少足够的临床证据。本研究结果显示，NPRL2在正常对照肝组织中的表达正常，而在肝癌组织中mRNA和蛋白表达水平均明显降低，提示NPRL2表达异常与肝癌发生密切相关。肝癌组织中NPRL2蛋白和mRNA的水平在Ⅲ-Ⅳ期较Ⅰ-Ⅱ期低，在有腹腔或腹膜后淋巴结转移组较无转移组低。这些结果都说明NPRL2的表达水平与肿瘤细胞的恶性程度呈负相关。NPRL2的低表达预示着患者的临床预后较差，NPRL2基因的表达情况可能作为反映肝癌生物学行为和判断患者预后的客观指标之一。在NPRL2表达明显下降或缺失的肝癌细胞中重新建立NPR12基因的表达可能能降低肿瘤细胞的恶性程度。